Name: a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

Författarna vill rikta sin tacksamhet för ekonomiskt stöd från Pasteur Foundation i New York (till JD, CS, CS), EU-FP7-programmet &quot;Automation&quot; (SLS), Institut Carnot-programmet 11 (till JD, AH , AR, RT, SLS) och projekt IMNOS (till RT, SLS), den Conny-Maeve välgörenhetsstiftelsen (SLS), European Masters i Molecular Imaging (IT), regionen Ile de France program MODEXA (SLS), Sesame (SLS) och DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Investissement de l&#39;avenir infrastrukturer Nation en Biologie-Santé: Frankrike LifebioImaging (FLI) Frankrike Life Imaging (RT, SLS), Frankrike Bioimaging (JD, SLS) och Institut Pasteur, Paris. Vidare vill författarna tacka José Bengoechea och Herbert Schweizer för reagenser. Vidare skulle Författarna tacka Cindy Fevre som genererade antikropparna.

1. Reagens <ol><li> Köp eller utveckla självlysande bakterier och lämpliga odlingsmedia såsom modifierad Escherichia coli som uttrycker lux ABCDE 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Förbered fysiologisk saltlösning (0,9% NaCl) och kulturmedialösningar enligt standardrecept. E. coli och K. pneumoniae odlades i Luria-Bertani (LB) vid 37 ° C, och V. fischeri och Photobacterium sp i LB kompletterat med 0,5 M NaCl vid 22 ° C. </li><li> Inköp eller förvärva fluorescerande prober, såsom Q-tracker 705 (40 nm i diameter, som kallas QD705), Q-tracker 800 (40 nm i diameter, som kallas QD800), fluorescerande (40 nm diameter) och icke-fluorescerande polystyren mikrosfärer ( 48 nm i diameter), och konventionella fluorescerande färger. </li><li> Förbered nödvändiga reagenser för bakteriell märkning. </li><li> Säkerställa tillgång tillett helt djur bioluminescens avbildare, såsom en IVIS Spectrum, som är i stånd att detektera signalen under ett brett spektrum av emissionsvåglängder och exponeringstider. En plattläsare kan mareld mätningar räcker för de flesta av de experiment som beskrivs här. </li></ol> 2. Grundläggande Sammanfattning av BRÄNSLE <ol><li> Med utgångspunkt från individuella kolonier på vanliga odlingsplattor, starta natten kulturer av självlysande bakterier. Här, V. fischeri användes. </li><li> Dagen för experiment, inleda nya subkulturer och låta dem utvecklas till en OD 600 av 1-1,5 uppnås. För att producera jämförbara resultat är det bäst att använda bakterier i samma tillväxtländer där de producerar intensiva signaler. Detta kan säkerställas genom att hålla OD 600 konstant. </li><li> Kombinera portioner av 100 l från vardera med antingen 5 pl av QD705 eller fysiologisk saltlösning (PS), och lägg sedan till 895 l av PS i standard spektroskopiska kyvetter. Placera de fyllda kyvetter i IVIS Spectrum och göra de mätningar under lämpliga filtersatser. Här var 710-730 nm emissionsfilter används. </li></ol> 3. Bränsle över olika avstånd <ol><li> Fyll två reducerad volym (1 ml) plast fotometriska kyvetter med antingen 50 | il QD705 eller 97,2 | il av icke-fluorescerande 48 nm polystyren-mikrosfärer i en total volym av 1 ml PS. Detta säkerställer liknande fast yta per totala volymen mellan de två enheterna. </li><li> Bered en ljuskälla kyvett genom att innesluta en tredje kyvett med standard svart tejp eller annat ogenomskinligt material i stånd att blockera ljus. Försiktigt förbereda två identiska optiska fönster på motsatta sidor av kyvetten. </li><li> Placera de tidigare fyllda kyvetter direkt på vardera sidan om ljuskällan kyvetten. Lägg en 1 ml alikvot av V. fischeri eller annan kultur (dvs. självlysande E. coli eller Photobacterium sp) från en ny subkultur i ljuskällan kyvetten och täck den med ett ogenomskinligt material, såsom svart papper för att minska eventuella ljusförorening. </li><li> Visualisera de tre kyvetter under lämpliga emissionsfilter såsom Total Ljus och 710-730 nm emissionsfilter, med exponeringstider på 10, 30 och 30 sekunder, respektive. </li><li> Flytta både externa kyvetter vid motsvarande extra avstånd från den centrala kyvetten, och sedan visualisera igen. Upprepa tills ett slutligt ansikte mot ansikte (central till minskad volym kyvett) avstånd på 3 cm uppnås. Vid varje steg, skaffa en fluorescens bild (450-480 nm excitation, 710-730 nm emission) för att validera QD705 platsen. </li></ol> 4. Undersöka Potentiella BRÄNSLE Pairs <ol><li> Fyll två reducerade volym kyvetter med 1 ml lösningar som innehåller antingen en fluorofor eller en fluorescerande nanopartikel av intresse för en, och PS eller PS med icke-fluorescerande nanopartiklar som den negativa kontrollen i den andra. I the arbete visade här, en mängd olika potentiella kommersiellt tillgängligt bränsle fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar undersöktes som beskrivs i tabell 1. </li><li> Lägg en 1 ml alikvot av färsk V. fischeri eller andra självlysande bakterier till en mörk ut tredje kyvett innehållande två fysiskt lika optiska fönster ligger på varsin sida. Täck kyvetten med en ogenomskinlig substans såsom en bit svart papper. </li><li> Vid en kort men lika avstånd plats de två reducerade volym kyvetter på vardera sidan av den mörklagda kyvett och visualisera under lämpliga filter. Här, var ett avstånd av 0,7 cm användes. Upprepa med andra fluoroforer. </li></ol> 5. Riktad FUEL <ol><li> Förbered biotinylerade antikroppar som är specifika för de självlysande bakterierna. Till exempel, här primära antikroppar specifika för K. pneumoniae (α-Kp) biotinylerades med användning av en lösning innehållande EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin. </li&gt; <li> Avlägsna överskottet av reagens från antikroppar med användning av avsaltningskolonner enligt centrifugering (1500 x g) under 2 min. </li><li> Använd en vanlig Bradford-analys för att bestämma proteinkoncentrationen och bestämma graden av antikropps biotinyleringen av HABA-analys. </li><li> Skaffa α-Kp-biot biotinylerad antikropp (Ab) partier genom att blanda 100 l (10 mM, upplöst i 1x PBS) med 40 l α-Kp antikropp, vilket resulterar i en slutlig substitutionsgrad av 16 biotinrester per Ab och en slutlig proteinkoncentration av 10 mg ml -1. </li><li> Med hjälp av flera natten replikera kulturer, rikta de tvättade bakterier med de tidigare nämnda antikropparna efter lämpligt protokoll. <ol><li> Specifikt tvätta K. pneumoniae i 1 x PBS och återsuspendera i 1 x PBS till en OD av 4 (ca 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1). </li><li> För varje replikera, inkubera 100 l PBS, α -Kp-antikroppar (10 | il α-Kp-biotB eller 10 | il PBS under kontrollen) och 100 | il celler under 90 min vid 30 ° C. Tvätta cellerna tre gånger i 1 x PBS och återsuspendera i 196 | il PBS. </li></ol></li><li> Märk cellerna med QD705 streptavidinkonjugat och dela upp dem i två ekvivalenta volymer. </li><li> Tvätta en lösning tre gånger, och sedan suspendera den i lämplig storlek. </li><li> Fördela 100 ^ il av de tvättade och otvättade lösningar i individuella brunnar i en svart 96-brunnars platta. Mät resulte luminiscens under Total Light, 490-510 nm och 710-730 nm filter. Fluoroforen koncentrationen kan bestämmas med hjälp av 450-480 nm excitation och 710-730 nm emission. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

Författarna förklarar konkurrerande ekonomiska intressen. JD, SB, KLR och SLS bidrog till europeiska patent EP10290158.4 och World Intellectual Property Organization patentansökan WO/2011/117847.

Den grundläggande demonstration av FUEL kan uppnås genom att helt enkelt blanda självlysande bakterier med fluorescerande nanopartiklar eller kvantprickar. De två enheterna kommer att vara fysiskt separerade och förblir bortom varje effektiv RET avstånd. Svårare är signalen optimering BRÄNSLE både in vitro och in vivo. Under in vitro-förhållanden, både med och utan en optisk absorbator närvarande, vanligtvis tillsats av ett överskott av fluoroforen kommer att vara tillräcklig för att maximera BRÄNSLE svar. Men vid höga koncentrationer företeelser som statisk eller kollisions släckning kan leda till en förlust av fluorescerande signal. Utföra en utspädningsserie genom att oberoende variera koncentrationen av det luminiscenta källan och fluoroforen kommer att hjälpa till att optimera de önskade koncentrationerna. Upprättande och optimering av bränsle under in vivo-koncentrationer är mycket svårare och måste behandlas från fall till fall. Det kan vara svårt att skapa en condition där fluorescerande enhet kan nås optiskt av självlysande källan. Som sådan kan börjar med direkt delprodukter injektioner av de två delarna tillhandahålla information avseende framgången med bränsle under optimala förhållanden. Standardprotokoll finns för märkning av bakterier och eukaryota celler med fluorescerande enheter såsom serien och QDs Alexa. Ofta innebär ytfunktionalisering eller aktivering med antikroppar, vilket kan leda till oönskade effekter såsom minskad cellviabilitet eller förändrad metabol aktivitet. För att övervinna detta, är det viktigt att bestämma den optimala mängden av antikropp eller aktiveringsmedel behövs som minimerar cellulära störningar samtidigt maximera den fluorescerande märkningen. Användning av kvantprickar är fördelaktigt på grund av deras karakteristiskt bred excitationsspektra, smala och avstämbar emissionsspektra, och möjligheten till ett stort Stokes-skift. Emellertid kan QDs vara cytotoxiskt och får inte vara önskvärt i vissa fall. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL är ett fenomen som förekommer i många Bret experiment 13 och kan tillämpas på en mängd olika självlysande och fluorescerande källor. Hittills har de fotoner som framställs BRÄNSLE behandlade produkten av icke-specifika interaktioner eller en olycklig bakgrundssignal som härrör från dåligt utformade BRET experiment. Det är bara med den typ av experiment visat här att vi kunde identifiera nyttan av denna oönskade signalen. I de exempel som visas, de luminiscerande Bakterierna fungerar som en diffus exciteringskälla med förmåga att framkalla en standard fluorescerande svar från ett stort antal olika fluorescerande enheter. På grund av den stora arbetsavstånd, är det säkert att dra slutsatsen att medan FUEL kan byggas utan att det uppstår BRET i allmänhet BRET kan inte observeras utan ett bidrag från BRÄNSLE. Huvudsakligen på grund av avsaknaden av en måls krav, FUEL kan användas för att täcka den rumsliga gap som finns mellan BRET och conventional hel-djur avbildningstekniker.

Den genetisk modifiering av organismer, såsom virus 1, 2, bakterier 3, eller små däggdjur 4 till antingen inducera eller konstitutivt uttryck mareld, har varit mycket framgångsrik och allmänt visade 5-7. Bioluminescence, en in vivo kemiluminiscerande reaktion innefattande naturligt förekommande reagens, har fördelen av att producera ljus utan behov av en extern ljuskälla. Som sådan, inte självlysande avbildning inte lider av de vanliga nackdelarna med auto-och icke-specifik signal finns från fluorescens avbildning 8. Följaktligen har mareld en signifikant signal-till-brus-förhållande eftersom alla detekterade signalen härstammar uteslutande från den avsedda källan. Även om många modeller har utnyttjat lux operonet från Photorhabdus luminescens (emissionsmaximum centrerad mellan 480 och 490 nm) för in vitro-och in vivo-applikationer 9, dess användning i små mammals har varit problematisk på grund av själva karaktären av bildförhållanden; den genomträngande förekomsten av optiska absorptionsmedel, såsom hemoglobin, och spridningsmedel, såsom vävnad och ben, hög grad påverkar blått till gult våglängder 3. Uttrycket av en konstruerad eldfluga luciferas (emissionsmaximum vid 617nm) har nyligen utvecklats och införlivats, ger ett verktyg som kraftigt övervinner optisk absorption 10, men är fortfarande föremål för spridning effekter. Som svar har det förekommit flera försök till röd-skift den utsända signalen till önskad optiska fönstret på 650-900 nm, en region med minimerad absorption och spridning, med hjälp av bioluminiscens resonansenergiöverföring (BRET) 11-13. Som ett verktyg för att förbättra signaldetektering, BRET, som använder en självlysande källa som givaren och en extra fluorofor som acceptor, har funnit begränsad framgång. Som ett nyskapande exempel på detta fenomen, &quot;självlysande kvantprickar4; (SIQDs) 14 består av modifierad Renilla reniformis luciferaser bundna till externa polymer-lysin lager av kommersiellt tillgänglig kvantprickar (QDs). Vid substrat Dessutom inducerar den resulterande självlysande reaktions fluorescens utsläpp från QDs, genererar en betydande produktion av röda fotoner. Emellertid har dessa SIQDs begränsad tillämpbarhet på in vivo visualisering av fysiologiskt relevanta händelser. Denna begränsade användbarhet beror sannolikt på att det är svårt att koppla den dubbla sond till organ, cell eller genen av intresse, eftersom de SIQDs inte kan genetiskt kodad och därför skulle kräva en sekundär modifiering av polymerskal. För att förbättra deras användbarhet, alternativa SIQDs, där luciferasema är bundna direkt till den självlysande kärnan, har nyligen varit anställd 15. Bygga bort av SIQD konceptet, var en mer tillämplig BRET systemet uppnås genom att fästa Cypridina luciferas till en idocyanine färgämne 16, som var i stånd att specifikt rikta tumörer i möss samtidigt som de producerar en betydande rött skifte från 460 nm till 675 nm. Att genomgå icke-strålande energiöverföring, BRET följer samma primära begränsningar som dess fluorescerande motsvarighet: det måste finnas en stark spektral överlappning mellan utsläpp givaren och acceptor excitationsspektra och arbetsavståndet mellan de två delarna måste vara i storleksordningen av Förster radie (5-14 nm, beroende på givarens-acceptorparet, med en effektiv maximalt avstånd på två gånger Förster radie 17). Detta avstånd beroende begränsar kraftigt de typer av händelser som kan observeras med hjälp av BRET som ett sätt att förbättra upptäckt. Nyligen kom en ny metod identifierades och visade i både in vitro och in vivo-förhållanden. Att bygga upp grunden för BRET, Fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL) 18, 19 </sup&gt; kräver också en stark spektral överlappning mellan det luminiscerande och fluorescerande komponenter. Men till skillnad från BRET är FUEL en helt strålnings process där den emitterade fotonen från självlysande källan absorberas av ett optiskt tillgänglig fluorofor, som sedan avger en röd-skiftat fotonen enligt fluoroforen kvantutbytet. Besläktad med BRET, kan också användas för detta tillvägagångssätt för att övervinna de begränsningar av bildbehandling i närvaro av optiska absorbenter. Den resulterande röda förskjutning ger en total ökning och specificitet i den detekterade signalen beroende på en minskning i dämpning och en minskning av optisk spridning effekter. FUEL har rapporterats förekomma mellan självlysande Escherichia coli som uttrycker lux-operon och QDs 18, 19. Medan experimentellt liknar de SIQDs föreligger en väsentlig skillnad: i bränslen, är det inte nödvändigt för det luminiscerande källan att vara fysiskt bunden till fluoroforen, vilket gör att for genetisk kodning av självlysande sonden. På grund av den framgångsrika detektionen av bränsle mellan luminescerande bakterier och QDs, är det möjligt att denna teknik skulle kunna tillämpas på både ytlig (hud) och djup vävnad (lungor, lever) infektioner, såsom Staphylococcus aureus och Klebsiellia pneumoniae. Sedan rapporten av dess experimentella betydelse har FUEL utvecklats till att omfatta en robust matematisk modell 20 som kan användas för att förutsäga acceptabel självlysande och fluorescerande par, och dess tillämpningar har utökats till att omfatta användning i identifiering av fotofysikaliska egenskaper såsom kvantutbyte. Vi beskriver nedan några av de grundläggande teknikerna för BRÄNSLE. Först visar vi belägg för detta fenomen över både korta (um) och lång (cm) arbetsavstånd, som i grunden skiljer BRÄNSLE från BRET. För det andra, vi utöka de möjliga BRÄNSLE paren genom att undersöka en mängd olika fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar. Third, är BRÄNSLE applikationer undersöks genom att jämföra målinriktade och icke-målinriktade BRÄNSLE par.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescens av Unbound Excitation från Luminescence (FUEL) är ett strålnings excitation-emission process som producerar ökad signal och kontrastförbättring in vitro och in vivo. BRÄNSLE delar många av de samma grundprinciper som mareld Resonance Energy Transfer (BRET), men skiljer sig mycket i de acceptabla arbetsavstånd mellan självlysande källan och den fluorescerande enhet. Medan BRET i praktiken begränsas till maximalt 2 gånger Förster radie, vanligen mindre än 14 nm, kan FUEL uppträda på avstånd upp till pm eller ens cm i avsaknad av en optisk absorbator. Här expanderar vi på den grund och tillämpning av BRÄNSLE genom att se över de aktuella principerna bakom fenomenet och visa sin kompatibilitet med ett brett utbud av fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar. Vidare är användbarheten av antikropp-riktad BRÄNSLE utforskas. Exemplen som visas här ger bevis för att FUEL kan utnyttjas för applications där BRET inte är möjligt, fyller den rumsliga tomrum som finns mellan BRET och traditionell hela djuret avbildning.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Utöka grunden och tillämpligheten av fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL) genom att kartlägga de relevanta principer och demonstrera dess kompatibilitet med en mängd fluoroforer och antikroppsinriktade villkor.

En Step Beyond BRET: Fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodynamik för membranprotein Folding Mätt fluorescensspektroskopi

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescens Lifetime Imaging of Molecular Rotorer i levande celler

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescens vid selektionstryck inkorporering av icke-kanoniska aminosyror och proteinanalys av masspektrometri och fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Skalbar tillverkning av töjbart, Dual Channel, ultrakalla orgel Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Genomföra flera Imaging lägen med en fluorescens Mikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...