Name: quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

De studies werden ondersteund door NIH HL75503 aan KP.

Alle experimenten uitgevoerd op dieren waren zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Tennessee Health Science Center. 1. Tubing voor perfunderen Rat Lung Voorbereidingen <ol><li> Bereid een buissysteem met Tygon-buis (# 18) voor bloed perfusie zoals getoond in figuur 1. Sluit drukopnemers (P23XL) en plaats de slang op de microscoop podium. </li><li> Stel waterbadtemperatuur tot 37 ° C. </li><li> Sluit de long en uitlaa...

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

De geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een eenvoudig hulpmiddel voor het bepalen van de permeabiliteit veranderingen in enkele long haarvaten. Wij pasten deze methode doorlaatbaarheid verandert in reactie op infusies van LPS te bepalen. Onze gegevens suggereren duidelijk dat LPS infusie veroorzaakt een toename van de microvasculaire permeabiliteit. Verder, de gegevens blijkt ook dat permeabiliteit veranderingen geïnduceerd door LPS waren vergelijkbaar in beide ...

Verhoogde microvasculaire permeabiliteit in de longen leidt tot ontwikkeling van alveolair oedeem evenals gemanipuleerde gasuitwisseling en is een belangrijk kenmerk van acute longbeschadiging (ALI) 1-3. De ramingen van vasculaire permeabiliteit zijn belangrijk bij het bepalen van de omvang van longbeschadiging en effectiviteit van voorgestelde therapeutische interventies. Gravimetrische analyse zoals bloed vrij long nat-naar-droog-verhouding en microvasculaire filtratie coëfficiënt worden veel gebruikte methoden voor het schatten permeabiliteit 4,5. Andere werkwijzen omvatten het kwantificeren het behoud van radioactieve of fluorescente probes in longweefsel 6-8. De bovenstaande methoden vereisen postexperiment verwerking longweefsel monsters naar het ophelderen van de permeabiliteit gegevens. Aangezien een dier alleen kan worden gebruikt voor een behandelingsprotocol, kunnen grote aantallen dieren vereist voor volledige studie. Een gemeenschappelijk kenmerk van de bovengenoemde werkwijzen is dat zij bepalen de gemiddelde vasculaire permeabiliteit vooralle bloedvaten in het weefselmonster. Het is echter bekend dat long micro-en macro-vaartuigen fenotypisch verschillend 9. Daarom kan permeabiliteit responsen heterogeen tussen de verschillende vlootsegmenten ook 9,10. Zo kwantificeren gemiddelde permeabiliteit van alle longvaten in een weefselmonster kan onvoldoende rekening met deze heterogeniteit. In de geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding, kan de bloedvaten op de long oppervlak worden gevisualiseerd door een rechtopstaande microscoop 4,11,12. Hierdoor kunnen karakteriseren reacties in enkele schepen en dus de afhandeling van heterogeniteit in de antwoorden 13. Bovendien, door gebruik van fluorescentie beeldvorming van microvaatjes, fluorescentie gebaseerde testen kunnen worden opgenomen. Verder kan een linker atrium microkatheter worden om middelen en fluorescentie probes leveren in bloedvaten 11,14. De microcatheter beperkt de levering aan een kleine long regio, aldus exposeren alleen de bloedvaten in de regio om de toegediende agenten en fluoroforen. Hierdoor kunnen meerdere kleine gebieden binnen dezelfde longen te worden gebruikt voor afzonderlijke experimenten, wat leidde tot een vermindering dieren nodig voor een studie. Real time beeldvorming maakt vangst van dynamische veranderingen in vasculaire en extravasculaire fluorescentie van enkele microvessels van de gïsoleerde voorbereiding. Zo moet in elk microvaatje in een afbeeldingsveld, veranderingen in fluorescentie gedurende infusie van fluoroforen en washoff kan worden geregistreerd en gekwantificeerd offline 14. Met behulp van de waarden van de maximale en de resterende vasculaire fluorescentie, kan een permeabiliteit index voor elke microvaatje binnen het beeldveld worden bepaald. Om doorlaatbaarheid verandert in reactie op ontstekingen of schadelijke stoffen te bepalen, kan de gewenste middel eerst worden toegediend en dan bepaald de permeabiliteit index. Bovendien kan het beeldveld overal ingesteld worden longzone toegediend als demicrokatheter, waardoor een hoge mate van flexibiliteit in de gewenste vasculaire netwerk. Zo is de geïsoleerde bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een aantrekkelijk experimenteel model om de permeabiliteit te kwantificeren in enkele long haarvaten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long preparaat wordt veel gebruikt visualiseren en definiëren signalering in enige microvaatjes. Door de koppeling van deze voorbereiding met real-time beeldvorming, wordt het mogelijk om de permeabiliteit in de individuele pulmonale bloedvaten te bepalen. Hierin beschrijven we stappen rattenlongen isoleren en perfuseren ze met autoloog bloed. Vervolgens schetsen we stappen om fluoroforen of agenten via een microkatheter bezielen in een kleine long regio. Met behulp van deze procedures beschreven, bepaalden wij permeabiliteit toename rattenlong microvaatjes in reactie op infusies van bacteriële lipopolysaccharide. De gegevens bleek dat lipopolysacharide toegenomen lek in zowel venular en capillaire microvessel segmenten. Dus deze methode is het mogelijk om de permeabiliteit antwoorden vergelijken tussen vasculaire segmenten en daarmee vast elke heterogeniteit in de respons. Terwijl gebruikelijke methoden longpermeabiliteit definiëren nabewerking vereisen longweefsel monsters, degebruik van real-time beeldvorming ondervangt deze eis zoals blijkt uit de huidige werkwijze. Zo is de gïsoleerde voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden om long microvasculaire permeabiliteit te bepalen, maar is een eenvoudige methode te ontwikkelen en te implementeren.

Geïsoleerd bloed geperfundeerd long preparaat verbonden met de perfusieslang en aanverwante apparatuur wordt getoond in figuur 2. Ter demonstratie, gebruikten we een Sprague Dawley rat, hoewel de hierin beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt met elke soort ratten. Infusions via een linker atrium microkatheter bereikt slechts een klein gebied van de long. De toegediende regio kan worden geïdentificeerd door de infusie veroorzaakte verkleuring (figuur 3). De long preparaat geposit...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Karakterisering van de geïsoleerde, geventileerde en Instrumented Mouse Lung geperfuseerd met pulsatiele flow

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

De Ex vivo Geïsoleerd Skeletal microvaatjes Voorbereiding Voor het onderzoek van vasculaire reactiviteit

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P<sub&gt; F</sub&gt;) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolatie van CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...