Name: quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00
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Gli studi sono stati supportati da NIH HL75503 a KP.

Tutti gli esperimenti condotti su animali erano come approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Tennessee Health Science Center. 1. Tubing preparati perfusione Rat Lung <ol><li> Preparare un sistema di tubi con tubi Tygon (# 18) per la perfusione di sangue come mostrato in Figura 1. Collegare trasduttori di pressione (P23XL) e posizionare il tubo sul palco microscopio. </li><li> Regolare la temperatura del bagno d&#39;acqua a 37 ° C....

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

La preparazione isolato polmone sangue perfuso accoppiato con immagini in tempo reale fornisce un semplice strumento per la determinazione delle variazioni di permeabilità in microvasi polmonari singoli. Abbiamo applicato questo metodo per definire cambiamenti di permeabilità in risposta alle infusioni di LPS. I nostri dati indicano chiaramente che LPS infusione provocato un aumento della permeabilità microvascolare. Inoltre, i dati indicano anche che i cambiamenti di permeabilità indotte da LPS erano simili in entr...

Aumento della permeabilità microvascolare nei polmoni porta allo sviluppo di edema alveolare e gli scambi gassosi compromessa ed è un importante caratteristica del danno polmonare acuto (ALI) 1-3. Pertanto, le stime di permeabilità vascolare sono importanti nel definire l&#39;entità del danno polmonare e l&#39;efficacia degli interventi terapeutici proposti. Analisi gravimetrica come rapporto polmone gratuito sangue wet-to-dry e coefficiente di filtrazione microvascolare sono ampiamente utilizzati metodi per stimare la permeabilità 4,5. Altri metodi includono quantificare la ritenzione di sonde radioattive o fluorescenti nel tessuto polmonare 6-8. Tuttavia, i metodi di cui sopra richiedono un&#39;elaborazione postexperiment di campioni di tessuto polmonare verso chiarire i dati di permeabilità. Inoltre, poiché un animale può essere utilizzato solo per un protocollo singolo trattamento, possono essere necessari grandi numeri di animali per uno studio completo. Una caratteristica comune dei metodi sopra descritti è che essi determinano la permeabilità vascolare medio pertutti i vasi sanguigni all&#39;interno del campione di tessuto. Tuttavia, è noto che polmonari micro-e macro-vasi sono fenotipicamente diversi 9. Quindi, risposte permeabilità possono essere eterogenei tra i vari segmenti di flotta e 9,10. Così, quantificando la permeabilità media di tutti i vasi polmonari in un campione di tessuto può non riflettere adeguatamente tale eterogeneità. Nella preparazione isolato polmone sangue perfuso, vasi sanguigni sulla superficie polmonare possono essere visualizzati tramite un microscopio verticale 4,11,12. In questo modo le risposte che caratterizzano in singoli vasi e, quindi, affrontare qualsiasi eterogeneità nelle risposte 13. Inoltre, utilizzando imaging di fluorescenza di microvasi, saggi di fluorescenza base possono essere incorporati. Inoltre, un microcatetere atriale sinistro può essere utilizzato per fornire agenti e sonde di fluorescenza nei vasi sanguigni 11,14. Microcatetere limita la consegna di una piccola regione polmonare, così exche propone solo i vasi sanguigni all&#39;interno della regione agli agenti infusi e fluorofori. Questo consente a più piccole regioni dello stesso polmone da utilizzare per esperimenti separati, portando ad una riduzione complessiva animali necessari per uno studio. L&#39;imaging in tempo reale consente l&#39;acquisizione dei cambiamenti dinamici nella vascolare e fluorescenza extravascolare singoli microvasi della preparazione polmone isolato. Così, per ogni microvasi all&#39;interno di un campo immagine, cambiamenti nella fluorescenza durante l&#39;infusione di fluorofori e washoff possono essere registrati, e quantificati in linea 14. Utilizzando i valori di fluorescenza massima e residua vascolare, un indice di permeabilità per ogni microvasi nel campo dell&#39;imaging può essere determinato. Per determinare le variazioni di permeabilità in risposta ad agenti infiammatori o pregiudizievoli, l&#39;agente desiderato può essere somministrato prima e poi l&#39;indice di permeabilità determinato. Inoltre, il campo dell&#39;immagine può essere regolato dovunque nella regione polmonare infusa dallomicrocatetere, consentendo così un elevato grado di flessibilità nella scelta della rete vascolare desiderato. Così, l&#39;isolato di sangue perfuso preparazione del polmone in tandem con le immagini in tempo reale fornisce un modello sperimentale interessante per quantificare permeabilità dei microvasi polmonari singoli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

La preparazione isolato polmone sangue perfuso è ampiamente usato per visualizzare e definire segnalazione in singoli microvasi. Accoppiando questa preparazione con la rappresentazione in tempo reale, diventa fattibile per determinare le variazioni di permeabilità delle singole microvasi polmonari. Qui descriviamo passi per isolare i polmoni di ratto e profumato con sangue autologo. Poi, abbiamo delineare misure per infondere fluorofori o agenti attraverso un microcatetere in una piccola regione del polmone. Utilizzando queste procedure descritte, abbiamo determinato un aumento della permeabilità nel ratto microvasi polmonari in risposta alle infusioni di lipopolisaccaride batterico. I dati hanno rivelato che lipopolisaccaride aumentata perdita di liquido in entrambi i segmenti venulare e capillare dei microvasi. Così, questo metodo permette di confrontare le risposte permeabilità tra segmenti vascolari e quindi, definisce alcun eterogeneità nella risposta. Mentre i metodi comunemente usati per definire la permeabilità polmonare richiedono post-elaborazione di campioni di tessuto polmonare, iluso di imaging in tempo reale evita questo requisito come evidente dal presente metodo. Così, la preparazione polmone isolato combinato con l&#39;imaging in tempo reale offre diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali per determinare la permeabilità microvascolare polmonare, ma è un metodo semplice per sviluppare e implementare.

Un isolato preparazione polmone sangue perfuso collegato al tubo per perfusione e relative apparecchiature è mostrato in Figura 2. A scopo dimostrativo, abbiamo usato un ratto Sprague Dawley, se le procedure qui descritte possono essere utilizzati con qualsiasi specie di ratto. Infusioni attraverso un microcatetere atriale sinistra raggiungono solo una piccola regione del polmone. La regione infuso può essere identificato dal scolorimento infusione indotta (Figura 3). La preparazione ...

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Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l&#39;imaging di fluorescenza in tempo reale.

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

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