Name: quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Studiene ble støttet av NIH HL75503 til KP.

Alle eksperimenter utført på dyr var som godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Tennessee Health Science Center. En. Tubing for perfusert Rat Lung Forberedelser <ol><li> Forbered et rørsystem med Tygon rør (18) for blod perfusjon, som vist i figur 1.. Koble trykktransdusere (P23XL) og plasser rørene på objektbordet. </li><li> Sett vannbad temperaturen til 37 ° C. </li><li> Koble lunge innløp og utløp midlertidig med Tygon slange. <...

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

Den isolerte blod-perfundert lunge forberedelser kombinert med sanntid bildebehandling gir et enkelt verktøy for bestemmelse av permeabilitet endringer i enkelt lunge microvessels. Vi har anvendt denne metode for å definere permeabilitet endres i respons til infusjon av LPS. Våre data klart tyder på at LPS infusjon forårsaket en økning i mikrovaskulær permeabilitet. Videre dataene indikerer også at permeabilitet endringer indusert av LPS var lik i begge venules og kapillærer. Således er en viktig fordel med de...

Økt mikrovaskulær permeabilitet i lungene fører til utvikling av alveolær ødem og kompromittert gassutveksling og er en viktig egenskap av akutt lungeskade (ALI) 1-3. Dermed estimater av vaskulær permeabilitet er viktige i å definere omfanget av lungeskade og effekt av foreslåtte terapeutiske intervensjoner. Gravimetrisk analyse slik som blod fri lunge våt-til-tørr-forhold og mikrovaskulær filtrering koeffisient er mye brukt metode for å estimere permeabilitet 4,5. Andre metoder omfatter kvantifisere oppbevaring av radioaktive eller fluorescerende prober i lungevevet 6-8. Men de ovennevnte metodene krever postexperiment behandling av lunge vevsprøver mot belyse permeabilitet data. Dessuten, siden ett dyr kan bare brukes for en enkelt behandling protokollen, store dyrenumre kan være nødvendig for en fullstendig undersøkelse. Et felles trekk ved de ovenfor angitte fremgangsmåter er at de bestemmer den midlere vaskulær permeabilitet foralle blodårene i vevsprøve. Imidlertid er det vel etablert at pulmonære mikro-og makro-fartøy er fenotypisk forskjellig ni. Derfor kan permeabilitet svarene være heterogene blant de ulike fartøysegmenter samt 9,10. Dermed kvantifisere gjennomsnittlig permeabilitet av alle lunge skip i en vevsprøve ikke nødvendigvis gjenspeile dette heterogenitet. I den isolerte blod-perfundert lunge forberedelse, kan blodårer på lungeoverflaten bli visualisert ved en oppreist mikroskop 4,11,12. Dette gjør karakteriserer reaksjoner i enkeltfartøy og dermed ta opp eventuelle heterogenitet i svarene 13. I tillegg, ved å benytte fluorescens-avbildning av microvessels, fluorescens-baserte assays kan være innarbeidet. Videre kan en venstre atrie microcatheter brukes til å levere agenter og fluorescens sonder i blodkar 11,14. Den microcatheter begrenser levering til et lite lunge-området, således exposerer bare blodårene i regionen til de infused agenter og fluorophores. Dette gjør at flere små regioner innen den samme lungen som skal brukes for separate eksperimenter, som fører til en samlet reduksjon i dyr som er nødvendig for en undersøkelse. Sanntid avbildning muliggjør fangst av dynamiske endringer i vaskulær og ekstravaskulær fluorescens av enkelt microvessels av den isolerte lunge forberedelse. Således, for hver microvessel innenfor et bildefelt, endringer i fluorescens i løpet av infusjon av fluoroforer og Awasking kan registreres, og kvantifiseres frakoblet 14.. Bruke verdier av maksimal og rest vaskulær fluorescens, kan en permeabilitet indeks for hver microvessel innen bildebehandling feltet bestemmes. For å bestemme endringer i gjennomstrømningen i respons til inflammatoriske eller skadelige stoffer, kan det ønskede middel administreres først, og deretter permeabiliteten indeksen bestemmes. I tillegg kan bildefeltet settes hvor som helst innenfor den tette region infusert medmicrocatheter, og muliggjør en høy grad av fleksibilitet ved valg av den ønskede vaskulære nettverk. Dermed blir isolert blod-perfundert lunge forberedelse i tandem med sanntid bildebehandling gir en attraktiv eksperimentell modell for å kvantifisere permeabilitet i enkelt lunge microvessels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

Den isolerte blod-perfundert lunge preparatet er mye brukt til å visualisere og definere signalering i enkelt microvessels. Ved å koble dette preparatet med sanntid bildebehandling, blir det mulig å bestemme permeabilitet endringer i individuelle lunge microvessels. Heri vi beskrive tiltak for å isolere rotte lungene og perfuse dem med autolog blod. Så, vi skissere tiltak for å sette mot fluoroforene eller agenter via en microcatheter inn en liten lunge regionen. Ved hjelp av disse prosedyrene som er beskrevet, vi bestemt permeabilitet økning i rotte lunge microvessels i respons til infusjoner av bakteriell lipopolysakkarid. Dataene viste at lipopolysakkarid økt væskelekkasje på tvers av både venular og kapillær microvessel segmenter. Således gjør denne metoden det mulig å sammenligne permeabilitet responser blant vaskulære segmenter, og dermed definere en hvilken som helst heterogenitet i respons. Mens vanlige metoder for å definere lunge permeabilitet krever etterbehandling av lunge vevsprøver, denbruk av sanntids avbildning unngår dette krav som framgår av den foreliggende fremgangsmåte. Således, den isolerte lunge preparatet kombinert med sanntids avbildning gir flere fordeler i forhold til tradisjonelle metoder for å fastslå lungemikrovaskulær permeabilitet, men likevel er en grei metode for å utvikle og implementere.

Et isolert blod-perfusjon lunge preparat som er koblet til perfusjon rør og tilhørende utstyr er vist i figur 2.. For demonstrasjonsformål, har vi brukt et Sprague Dawley-rotte, selv om fremgangsmåtene som er beskrevet her kan brukes med alle rotter arter. Infusjoner gjennom en venstre atrie microcatheter nå bare et lite område av lungen. Den tilført regionen kan identifiseres ved infusjon-indusert misfarging (Figur 3). Lungene preparat som posisjonert for sanntids avbildning er ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

Det isolerte blod-perfusjon lunge preparatet gjør det mulig å visualisere microvessel nettverk på lungeoverflaten. Her beskriver vi en tilnærming til å kvantifisere permeabilitet av enkelt microvessels i isolerte lungene ved hjelp av sanntids fluorescens bildebehandling.

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

Det Ex vivo Isolert Skeletal Microvessel Forberedelse for etterforskning av vaskulær reaktivitet

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parameter Måling av permeabilitet Transition pore åpningen i Isolert Mouse Hjerte Mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-kanal Analyse og Kalsium Imaging i Podocytes av nyisolerte glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Technique å etterforske Regulering av microvessel Permeabilitet i Rat mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolering av CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung Mesenchymale stromale celler fra Rat Lunger

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Musen isolerte perfuserte Nyre Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...