Name: quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00
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Os estudos foram apoiados pelo NIH HL75503 para KP.

Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Tennessee Health Science Center Animal Care Institucional e uso. 1. Tubulação de preparações perfusão Rat Lung <ol><li> Preparar um sistema de tubos com um tubo Tygon (# 18) para a perfusão de sangue como mostrado na Figura 1. Ligue transdutores de pressão (P23XL) e colocar o tubo na platina do microscópio. </li><li> Ajustar a temperatura do banho de água a 37 ° C. </li><l...

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

A preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue combinado com imagens em tempo real fornece uma ferramenta simples para a determinação de alterações de permeabilidade em microvasos pulmonares individuais. Aplicamos esse método para definir alterações de permeabilidade em resposta à infusão de LPS. Os nossos dados sugerem claramente que a infusão de LPS causou um aumento da permeabilidade microvascular. Além disso, os dados também indicam que as alterações de permeabilidade induzida por LPS foram si...

O aumento da permeabilidade microvascular nos pulmões leva ao desenvolvimento de edema alveolar e troca gasosa comprometida e é uma das principais características da lesão pulmonar aguda (LPA) 1-3. Assim, estimativas da permeabilidade vascular são importante na definição do grau de lesão dos pulmões e a eficácia das intervenções terapêuticas propostas. Análise gravimétrica como proporção wet-a-seco de pulmão livre sangue e coeficiente de filtração microvascular são amplamente utilizados métodos para estimar a permeabilidade 4,5. Outros métodos incluem a quantificar a retenção de sondas radioactivas ou fluorescentes no tecido pulmonar 6-8. No entanto, os métodos descritos acima requerem processamento postexperiment de amostras de tecido do pulmão para elucidar os dados de permeabilidade. Além disso, uma vez que um animal pode ser usado somente para um único protocolo de tratamento, pode ser necessário um grande número de animais para o estudo completo. Uma característica comum dos métodos acima é que eles determinam a permeabilidade vascular significativo paratodos os vasos sanguíneos no interior da amostra de tecido. No entanto, é bem estabelecido que o micro e macro-vasos pulmonares são fenotipicamente diferente 9. Por isso, as respostas de permeabilidade pode ser heterogênea entre os diversos segmentos de navios, bem 9,10. Assim, a quantificação da permeabilidade média de todos os vasos pulmonares em uma amostra de tecido pode não refletir adequadamente esta heterogeneidade. Na preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue, dos vasos sanguíneos na superfície do pulmão podem ser visualizados por um microscópio vertical 4,11,12. Isto permite que caracterizam as respostas em vasos individuais e, assim, tratar qualquer heterogeneidade na resposta 13. Além disso, através da utilização de imagens de fluorescência de microvasos, ensaios de fluorescência com base pode ser incorporada. Além disso, um microcateter atrial esquerda pode ser utilizado para fornecer agentes e as sondas de fluorescência nos vasos sanguíneos 11,14. O microcatheter limita a entrega a uma região de pulmão de pequenas, assim, exposando apenas os vasos sanguíneos na região, para os agentes infundidos e fluoróforos. Isto permite que várias pequenas regiões dentro do mesmo pulmão a ser utilizado para experiências em separado, levando a uma redução global de animais necessários para um estudo. Imagens em tempo real permite a captura de mudanças dinâmicas na vascular e fluorescência extravascular de microvasos individuais da preparação de pulmão isolado. Assim, para cada um dos microvasos dentro de um campo de imagem, as alterações na fluorescência durante a infusão de fluoróforos e washoff pode ser gravada, e quantificado desligada 14. Usando valores de fluorescência máximo e residual vascular, um índice de permeabilidade para cada microvasos no campo de imagem pode ser determinada. Para determinar as alterações de permeabilidade na resposta aos agentes inflamatórios ou prejudiciais, o agente desejado, pode ser administrado em primeiro lugar e, em seguida, o índice de permeabilidade determinada. Além disso, o campo de imagem pode ser colocado em qualquer lugar dentro da região do pulmão infundida pelamicrocatheter, permitindo assim um elevado grau de flexibilidade na escolha da rede vascular desejado. Assim, a preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue em conjunto com imagens em tempo real fornece um modelo experimental atraente para quantificar permeabilidade em microvasos pulmonares individuais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

A preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue é amplamente usado para visualizar e definir a sinalização em microvasos individuais. Juntando esta preparação com imagens em tempo real, torna-se viável para determinar alterações da permeabilidade em microvasos pulmonares individuais. Aqui nós descrevemos etapas para isolar pulmões de ratos e perfundem-los com sangue autólogo. Em seguida, descrevemos as etapas para infundir fluoróforos ou agentes através de um microcatheter em uma região de pulmão de pequenas. Utilizando estes procedimentos descritos, determinou-se o aumento da permeabilidade em microvasos de pulmão de rato em resposta a infusões de lipopolissacarídeo bacteriano. Os dados revelaram que lipopolissacarídeo aumento de fugas de fluido em ambos os segmentos venulares e microvasos capilar. Assim, este método faz com que seja possível comparar as respostas de permeabilidade entre os segmentos vasculares e, assim, definir qualquer heterogeneidade na resposta. Enquanto os métodos comumente utilizados para definir a permeabilidade pulmonar requerem pós-processamento de amostras de tecido do pulmão, ouso de imagens em tempo real elimina esta exigência, como é evidente a partir do presente método. Assim, a preparação de pulmão isolado combinado com a imagem em tempo real oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais para determinar a permeabilidade microvascular pulmão, ainda é um método simples para desenvolver e implementar.

Uma preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue ligado ao sistema de perfusão e afins é mostrado na Figura 2. Para fins de demonstração, foi utilizado um rato Sprague Dawley, embora os procedimentos aqui descritos podem ser utilizados com qualquer espécie de rato. Infusões com um microcateter atrial esquerdo atingir apenas uma pequena região do pulmão. A região infundido pode ser identificado pela descoloração induzida por infusão (Figura 3). A preparação de pulm?...

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Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

A preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue faz com que seja possível visualizar redes microvasos na superfície do pulmão. Aqui nós descrevemos uma abordagem para quantificar a permeabilidade de microvasos de solteiro em pulmões isolados tempo real usando imagens de fluorescência.

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

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