Name: quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Исследования были поддержаны NIH HL75503 в КП.

Все эксперименты, проведенные на животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Теннесси Научного центра здоровья на. 1. Шланги для препаратов перфузии легких крыс <ol><li> Подготовьте систему труб с Tygon трубки (# 18) для перфу...

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

Выделенный крови перфузии подготовка легких в сочетании с изображениями в режиме реального времени предоставляет простой инструмент для определения изменений проницаемости в отдельных микрососудов легких. Мы применили этот метод для определения изменения проницаемости в ответ на ?...

Увеличение микрососудов проницаемость в легких приводит к развитию альвеолярного отека и скомпрометированной газообмена и является основной характеристикой острого повреждения легких (ALI) 1-3. Таким образом, оценки проницаемости сосудов играют важную роль в определении степени повреждения легких и эффективности предложенных терапевтических вмешательств. Гравиметрического анализа, таких как кровяное бесплатно легких мокрого на сухой отношение и коэффициента фильтрации микрососудов широко используются методы для оценки проницаемости 4,5. Другие способы включают количественное определение удержание радиоактивных или флуоресцентных зондов в легочной ткани 6-8. Однако, эти методы требуют postexperiment обработку образцов легочной ткани на выяснение данных проницаемости. Кроме того, поскольку одно животное может быть использован только для одного протокола лечения, большое количество животных могут быть необходимы для полного исследования. Общей характеристикой описанных выше способов является то, что они определяют среднюю сосудистую проницаемость длявсе кровеносные сосуды внутри образца ткани. Тем не менее, хорошо известно, что легочные микро-и макро-сосуды фенотипически отличается 9. Таким образом, ответы проницаемости может быть гетерогенным среди различных сегментов сосудов, а 9,10. Таким образом, количественного среднее проницаемость всех легочных сосудов в образце ткани не могут адекватно отражать эту неоднородность. В изолированной перфузии кровью подготовки легких, кровеносных сосудов на поверхности легких могут быть визуализированы с помощью вертикального микроскопа, 4,11,12. Это позволяет, характеризующие ответы в одиночных судов и, таким образом, решения любых гетерогенность в ответах 13. Кроме того, с использованием флуоресцентной визуализации микрососудов, флуоресцентные анализы на основе могут быть включены. Кроме того, левого предсердия Микрокатетер могут быть использованы для доставки агентов и флуоресценции зондов в кровеносные сосуды 11,14. Микрокатетер ограничивает доставку в небольшой области легких, таким образом, экссоздает только кровеносные сосуды внутри региона к инфузии агентов и флуорофорами. Это позволяет использовать несколько небольших регионов в рамках одной легких, которые будут использоваться для отдельных экспериментов, что привело к общему снижению животных, необходимых для исследования. Изображений в режиме реального времени позволяет захват динамических изменений в сосудистой и внесосудистой флуоресценции одиночных микрососудов изолированной подготовки легких. Таким образом, для каждого микрососудов в пределах области изображения, изменения флуоресценции во время инфузии флуорофоров и washoff могут быть записаны, и количественно в автономном режиме 14. Использование значений максимальной и остаточной флуоресценцией сосудов, индекс проницаемости для каждого микрососудов в области формирования изображения может быть определена. Для определения изменения проницаемости в ответ на воспалительные или вредных веществ, требуемый агент может быть введен, а затем индекс проницаемости определен. Кроме того, поле изображения может быть установлен в любом месте в пределах области легких учитывающеймикрокатетер, таким образом обеспечивая высокую степень гибкости в выборе нужную сеть сосудов. Таким образом, изолированные крови перфузии подготовка легких в тандеме с изображениями в реальном времени обеспечивает привлекательный экспериментальную модель для количественной проницаемость в единичных микрососудов легких.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

Выделенный крови перфузии подготовка легких широко используется для визуализации и определения сигналов в одиночных микрососудов. Объединяя этот препарат с изображениями в режиме реального времени, становится возможным определить изменения проницаемости в отдельных легочных микрососудов. Здесь мы опишем шаги, чтобы изолировать легких крыс и заливать их с аутологичной крови. Тогда, мы наметим шаги, чтобы вселить флуорофоры или агентов через микрокатетера в небольшой области легких. Используя эти методики, описанные, мы определили повышение проницаемости микрососудов в легких крыс в ответ на вливаний бактериального липополисахарида. Данные показали, что липополисахарид увеличился утечки жидкости через обе венулярный и капиллярная микрососудов сегментов. Таким образом, этот метод позволяет сравнить ответы проницаемости среди сосудистых сегментов и, таким образом, определить любое гетерогенность в ответе. В то время как часто используемые методы, чтобы определить проницаемость легких требуют постобработки образцов легочной ткани,Использование визуализации в реальном времени это требование исключает Как видно из настоящего способа. Таким образом, изолированные подготовка легких в сочетании с изображениями в реальном времени имеет ряд преимуществ перед традиционными методами для определения легких микрососудов проницаемость, но это простой способ для разработки и реализации.

Изолированная крови перфузии легких препарат подключен к трубопроводу перфузии и соответствующего оборудования показан на рисунке 2. Для демонстрационных целей мы использовали крысу Sprague Dawley, хотя процедуры, описанные здесь, могут быть использованы с любым видам крыс. Настои...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Количественная Single микрососудов проницаемость в изолированном крови-перфузии Rat Подготовка легких

Выделенный крови перфузии подготовка легких делает возможным визуализировать микрососудов сетей на поверхности легких. Здесь мы опишем подход к количественной проницаемость отдельных микрососудов в изолированных легких использованием изображений в режиме реального времени флуоресценции.

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Стандартизированные Подготовка одноклеточных суспензий от мыши легочной ткани использованием gentleMACS диссоциатор

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Подготовке высококвалифицированных Связанные сердце крысы Митохондрии

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Характеристика Изолированные, вентилируемый и легких мыши Instrumented озарен пульсирующего потока

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

Бывший естественных условиях Изолированный скелета Подготовка микрососудов для исследования сосудистой реактивности

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Одноканальный анализ и Кальций изображений в подоцитов в Свежевыделенные клубочков

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Выделение CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident легких мезенхимальных стромальных клеток крысы легких

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Мышь Изолированные перфузировались почки Техника

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...