Name: isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke fru Meike Schaffrinski for hendes altid fremragende teknisk bistand i løbet af de sidste par år. Dette arbejde blev finansieret gennem Forskningsrådet tysk (DFG) i den fælles forskning gruppe 942 (FOR942) og forskningsprogrammet for Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Georg-August-Universität Göttingen.

1. Fremstilling af sterilt humant AB serum <ol><li> Saml 4-5 poser af frisk frosset plasma (FFP). Store poser på -20 ° C, indtil nok poser er blevet indsamlet. </li><li> Optø poser og inkuberes i 30 minutter ved 56 ° C i et vandbad for at inaktivere komplement og fjerne fibrin. </li><li> Grundigt desinficere ydersiden af ​​poserne og overføre plasmaet til 50 ml rør. </li><li> Der centrifugeres ved 3.000 xg i 15 minutter ved stuetemperatur for at slippe af bundfald og resterende blodplader. </li><li> Pool alle supernatanter og smid pillerne. </li><li> Alikvot serumprøver i 15 ml rør og opbevares ved -20 ° C. BEMÆRK: Alternativt kan kommercielt tilgængelige varmeinaktiveret normalt humant AB-serum anvendes. </li></ol> 2. Isolering af monocytter For at lette afbalancering af centrifugen, anbefales det at behandle to fibrinlag parallelt. Dog tage CAre at anvende separate materialer til hver donor og ikke at blande cellerne. Hvis der ikke kan opnås fibrinlag let kan 400 ml hepariniseret perifert blod anvendes i stedet. <ol><li> Desinficere forsigtigt plastposer indeholdende buffy coats og overføre indholdet af hvert fibrinlaget til to 50 ml rør. </li><li> For hver fibrinlag udfylde tre 50 ml rør med 15 ml Ficoll-opløsning (1,077 g / ml). Ficoll bør være ved stuetemperatur i præparatet. </li><li> Lag 30-35 ml buffy coat blod oven på Ficoll løsning for første densitetsgradient. Vær omhyggelig med at gøre dette langsomt og forsigtigt for at undgå at blande begge lag. </li><li> Centrifugeres ved 400 x g uden bremse i 30 minutter ved stuetemperatur. </li><li> For hver gradient indsamle hvid ring af perifere mononukleære blodceller (PBMC&#39;er), som er placeret mellem de to faser med en plastik Pasteur-pipette og overføres til et 50 ml rør. </li><li> Fyld hvert rør med PBS-EDTA (1 mM) til 40 ml i alt. </li><li> Centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter uden bremse ved stuetemperatur. </li><li> Aspirer supernatanten og vask pellet igen med 40 ml PBS-EDTA (1 mM). </li><li> For hver donor pulje pellets i 20 ml RPMI-1640 uden phenolrødt + 10% FCS. </li><li> Forbered isoosmotisk Percoll-opløsning til den anden densitetsgradient: Ved to donorer blande 23,13 ml Percoll-opløsning (densitet: 1,131 g / ml) i et 50 ml rør med 1,87 ml 10-fold PBS. Derefter overføres 23 ml af denne opløsning til et nyt 50 ml rør, og der tilsættes 27 ml RPMI-1640 med phenolrødt + 10% FCS til opnåelse af en 46% iso-osmotisk Percoll-opløsning. Percoll bør være ved stuetemperatur i præparatet. </li><li> For hver donor blev 25 ml af den fremstillede Percoll-opløsning til et 50 ml rør og lag PBMC opløsning fremstillet i 2,9) på toppen af ​​Percoll-opløsning. Vær omhyggelig med at gøre dette meget langsomt end omhyggeligt begge lag har tendens til at blande let. Hvis det gøres korrekt, kan der skelnes mellem de to faser på grund af deres forskel i farve. </li><li> Centrifugeres ved 550 x g uden bremse i 30 minutter ved stuetemperatur. </li><li> For hver gradient indsamle hvid ring af monocytter, som er placeret mellem de to faser med en plastik Pasteur-pipette og overføres til et 50 ml rør. </li><li> Fyld hvert rør med PBS-EDTA (1 mM) op til 50 ml i alt. </li><li> Centrifugeres ved 400 xg i 10 minutter uden bremse ved stuetemperatur. </li><li> Aspirer supernatanten og resuspender pellets i 20 ml RPMI-1640 med phenolrødt + 10% FCS. </li></ol> 3. Differentiering af monocytter til makrofager <ol><li> Bestem antallet af isolerede monocytter i en 1:10 fortynding i trypanblå. Tæller kun de store, ofte uregelmæssigt formede celler, der er monocytter. Må ikke regne de mindre, runde-formede celler, der er lymfocytter. NOTE: Monocyt tal ikke skal bestemmes for præcist fordi de kun give et vink om, hvor mange og hvilke FEP teflonbelagt poser (små eller store) skal anvendes til differentiering af cellerne. </li><li> For 1,0-1,5 x 10 8 monocytter fra en donor, frø cellerne i en stor FEP teflonbelagt cellekultur taske. For hver pose forberede dyrkningsmediet bestående af 174 ml RPMI-1640, 2% humant AB serum (som fremstillet i afsnit 1), 1% penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml M-CSF (samlet volumen: 180 ml). <ol><li> Til 3,0-5,0 x 10 7 monocytter fra en donor, frø cellerne i en lille teflonbelagt cellekultur taske. For hver pose forberede dyrkningsmediet bestående af 28,5 ml RPMI-1640, 2% humant AB serum (som fremstillet i afsnit 1), 1% penicillin / streptomycin og 2,5 ng / ml M-CSF (samlet volumen: 30 ml). BEMÆRK: Hvis fx er 8,0 x 10 7 monocytter opnået, anbefaler vi til frø dem i two mindre volumen poser med 4,0 x 10 7 celler hver. I stedet for M-CSF, kan monocytter alternativt differentieres med granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) ved den samme koncentration (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Tilføj cellesuspensionen (20 ml) til den fremstillede medium og blandes omhyggeligt. Hvis to poser fremstilles fra en donor, der tilsættes 20 ml RPMI-1640 til cellesuspensionen og derefter tilføje halvdelen af ​​suspensionen til hvert medium præparat. </li><li> Valgfrit: Hvis du vil afgøre, om forberedelse monocyt- er forblevet steril, rive en dråbe cellesuspensionen på en blodagarplade og inkuberes natten over ved 37 ° C. </li><li> Stram kappe af en 50 ml Perfusionssprøjten på stikket til FEP teflonbelagt cellekultur pose og fyld den med den forberedte celle suspension. </li><li> Tag sprøjten og skubbe den resterende luft ud af posen. Luk posen med en afsluttende kegle. </li><li> Inkubér poser til 6-7 dage ved 3776; C med 5% CO2. </li></ol> 4. Macrophage Harvest <ol><li> Placer FEP teflonbeklædte cellekultur poser med de differentierede makrofager på is i mindst 1 time for at lette frigørelse af celler (en inkubation på op til 3 timer er mulig). Sørg for, at hele overfladen af ​​posen er dækket med is. </li><li> Træk posen med minimalt tryk 10x over kanten af ​​et skrivebord / bord. </li><li> Desinficere forsigtigt ydersiden af ​​posen, og fjern den afsluttende kegle. </li><li> Spænd en 50 ml sprøjte på stikket af posen, fjern cellesuspensionen, og overføre den til 50 ml rør. </li><li> Centrifugeres ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur til spin ned cellerne. </li><li> Aspirer supernatanten og samle pellets fra en pose i 10 ml RPMI-1640 + 10% FCS i alt. </li><li> Bestem celleantal i et hæmocytometer (1: 4-1: 10 fortynding i trypanblåt). Kun tæller de store runde celler. BEMÆRK: Når differentiere makrofager i FEP teflonbeklædte poser, kan der være resterende celler, fx lymfocytter, afhængig af donor og på kvaliteten af monocyt isolation. </li><li> At genanvende de FEP teflon-belagte poser, vaske dem to gange med 70% ethanol for at fjerne resterende celler. Fyld dem med 50 ml 70% ethanol og inkuberes natten over. Vask poser 3x med sterilt PBS, pak dem ind i sterilisering papir, og der steriliseres i en autoklav ved anvendelse af standardprocedurer. BEMÆRK: cellekultur poser kan genbruges flere gange uden tab i makrofag udbytter. Imidlertid besluttede vi at kassere de poser efter 10 anvender, før de begynder at lække. </li><li> For efterfølgende eksperimenter kultur makrofager i RPMI-1640 + 10% FCS. Hvis lavere serumkoncentrationer er nødvendige, dyrkning i RPMI-1640 med 1% FCS er også muligt. Frø og inkuber cellerne i 3-4 timer. Efter denne periode, opmærksom på, at makrofager tillægger overfladen af ​​celledyrkningsskål menskontaminerende celler (dvs. erythrocytter, lymfocytter og dendritiske celler) forblive i suspension. Vask cellerne mindst to gange med PBS for at fjerne ikke-adhærente celler. </li><li> Aftagning dyrkede makrofager fra celledyrkningsskål til yderligere forsøg forsigtigt at skrabe dem væk fra overfladen. Alternativt inkuberes retter til 20 minutter på is, aspirere dyrkningsmediet, og der tilsættes 1 ml enzymfri celledissocieringsopløsning puffer. Efter 5 minutters inkubation ved 37 ° C, tilsættes 4 ml PBS og frigøre celler ved pipettering op og ned i mindst 3 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre som ingen interessekonflikt eksisterer.

Makrofager er vigtige effektorceller i det medfødte immunsystem og vise vigtige funktioner i immunmodulation, antigenpræsentation og vævshomeostase. På grund af deres bemærkelsesværdige plasticitet, de er i stand til at reagere på forskellige stimuli med ændringer i deres fænotype. Dog er hidtil en masse data om makrofag polarisering opnået i det murine systemet, selvom der er rapporter, der viser, at kun omkring 50% af makrofag polarisering markører kan direkte oversættes fra mus til menneske 16. Derfor præsenterer vi her en metode til at opnå primære humane makrofager i tilstrækkeligt antal og renhed uden behov for dyre materialer, f.eks MACS magnetiske perler eller en modstrøms centrifugal elutriation enhed. Vores fremgangsmåde er baseret på isolering af monocytter fra PBMC&#39;er og deres efterfølgende differentiering til makrofager i FEP teflonbelagt cellekultur poser i nærvær af lave koncentrations af M-CSF 11-13. Mens monocytter udgør mindre end 5 til 10% af perifere blod leukocytter hos mennesker, ved stimulering de ansættes til perifere steder, hvor de differentierer til hjemmehørende vævsmakrofager eller dendritiske celler 17. Cytokinet M-CSF er vigtig for monocyt overlevelse og driver deres differentiering til makrofager 18,19. Hidtil har de M-CSF koncentrationer, som blev udvalgt til monocyt differentiering lå op til 100 ng / ml, men i vores protokol vi er i stand til at opnå et tilstrækkeligt antal modne makrofager med en M-CSF koncentration på kun 2,5 ng / ml 12 20. Desuden dyrkes cellerne i FEP teflonbeklædte cellekultur poser, der letter frigørelse af makrofager og deres efterfølgende såning i definerede celleantal. Da poserne kan genbruges flere gange, dette yderligere nedsætter omkostningerne til isolering proces. De makrofager opnået ved denne fremgangsmådeer yderst positivt for CD45, CD14, CD11, CD11 c og vise udtryk for mannosereceptoren CD206 som argumenterer for en population af rene, modne makrofager 21,22. Især høj CD14 udtryk er typisk for makrofager differentierede under tilstedeværelse af M-CSF 23. Efter udsåning af cellerne, de udviser en hurtig tilslutning til plastoverflader med nogle celler, der viser en typisk spindel-lignende morfologi, mens andre udviser et spejlæg fænotype. Dette er i overensstemmelse med observationer fra andre forfattere 18,22,24. Det blev rapporteret, at monocyt differentiering i nærværelse af M-CSF fører til M2-polariserede makrofager 16,25. Imidlertid makrofager isoleret ved vores protokol er stadig i stand til at reagere på en lang række stimuli, herunder udsættelse for tumorceller afledt mikrovesikler og co-kultur med tumorceller 26,27 eller udsættelse for LPS, som de reagerer med induktion af pro- inflammatoriske gener, såsom IL-1 &amp;# 946 ;, TNFa Wnt5a eller forskellige matrixmetalloproteinaser, der betragtes som typiske for M1-polariserede makrofager 3,5,28. Konklusionen er, at isolation af monocytter efter dobbelt densitetsgradient centrifugering og efterfølgende differentiering i retning af makrofager i FEP teflonbeklædte cellekultur poser resulterer i høje antal makrofager uden behov for teknisk vanskelige eller dyre procedurer. De opnåede makrofager kan anvendes til efterfølgende analyse spænder fra klassisk aktivering via LPS til co-kultur med tumorceller.

Celler fra monocytlinjen og deres terminalt differentierede derivater - makrofager - udviser en slående plasticitet i forhold til deres biologiske funktion, der fører til deres deltagelse i så forskellige processer som udvikling, væv reparation, og immunitet 1. Sidstnævnte skyldes deres fagocytiske og antigen-præsenterende evne som placerer makrofager på skillevejen mellem immunrespons medfødte og adaptive 2. Men deres evne udskille cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer og andre signalmolekyler 1 ikke blot øger deres immun-modulerende funktion, men tjener også som grundlag for deres ekstra funktioner. Forsøg på at afspejle disse forskellige aktivering trin i forbindelse med ikke-mikrobielle medierede forhold har resulteret i kategorierne M1 og M2 3. Mens denne klassificering ikke er fuldstændig, giver det mulighed for en grundlæggende forståelse af makrofag biologi. På grund af disse mangeartede funktioner det kommer ikke som nogen overraskelse, at makrofager er forbundet med mange forhold, der på en eller anden måde involverer vævsombygning eller betændelse. Ved siden af deres grundlæggende rolle i anerkendelse og clearance af invaderende patogener 4-6, er makrofager i stigende grad kommet i fokus i åreforkalkning, fibrose, fedme og kræft 7-10. En reproducerbar metode til frembringelse af humane makrofager er derfor afgørende for en forståelse af disse patologier. Her præsenterer vi en metode baseret på isolering af humane monocytter fra perifert blod fra raske donorer ved en dobbelt densitetsgradientcentrifugering teknik som beskrevet tidligere 11. For at lette differentiering i retning af makrofager, er de isolerede monocytiske celler inkuberet i nærvær af lave koncentrationer af M-CSF og normalt humant serum 12. For at lette yderligere håndtering og cellehøst er differentiering udført i gaspermeabel FEPTeflonbelagte cellekultur poser med en hydrofob overflade 12-15. De resulterende hvilende makrofager kan blive udsat for en bred vifte af assays, som de er stadig i stand til at reagere i enten en M1 eller M2-lignende måde. Alternative metoder til monocyt isolation og efterfølgende differentiering såsom magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) eller modstrøm centrifugal elutriering (CCE) har nogle begrænsninger med hensyn til udbytte, omkostninger og tid, der kræves. Den heri beskrevne protokol giver den fordel, at det kan udføres med standard laboratorieudstyr uden behov for særlige reagenser (f.eks MLA magnetiske perler) eller udstyr (f.eks apparater CCE) og giver mulighed for behandling af store mængder af celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Humane makrofager er involveret i et væld af patologiske processer lige fra infektionssygdomme til kræft. Således udgør de et værdifuldt værktøj til at forstå de underliggende mekanismer i disse sygdomme. Vi har derfor præsentere en enkel protokol til isolering af humane monocytter fra buffy coats, efterfulgt af en differentiering procedure, som resulterer i høje makrofag udbytter. Teknikken meste afhængig almindeligt tilgængelige laboratorieudstyr og dermed giver en pris og tid effektiv måde at opnå store mængder af humane makrofager. Kort fortalt buffy coats fra raske bloddonorer underkastet en dobbelt densitetsgradientcentrifugering at høste monocytter fra perifert blod. Disse monocytter dyrkes derefter i fluorerede ethylenpropylen (FEP) Teflon-belagt cellekultur poser i nærvær af makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF). De opdelte makrofager let kan høstes og anvendes til efterfølgende undersøgelser og funktionellesiger. Vigtige metoder til kvalitetskontrol og validering af isolering og differentiering skridt vil blive fremhævet i protokollen. Sammenfattende protokollen beskrevet her giver forskerne rutinemæssigt og reproducerbart isolere humane makrofager uden behov for omkostningseffektive intensiv værktøj. Endvidere kan sygdomsmodeller studeres i et syngen menneskelige system omgår anvendelsen af ​​murine makrofager.

Den første densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af Ficoll giver en hvid interfase indeholdende PBMC&#39;er (figur 1A) dvs. lymfocytter og monocytter. Dette kan bekræftes ved en May Gruenwald-farvning (figur 1B og C) af de indsamlede celler, som viser både et højt kerne / cytoplasma-forhold (typisk af lymfocytter) og bean- eller ringformede kerner (typisk for monocytter). Når disse celler bliver derefter fyldt på en anden densitetsgradient under anvendelse af Percoll kan monocytter yderligere adskilt fra lymfocytterne og igen vises som et hvidt interfase (figur 1D-F). For hver fibrinlaget den beskrevne dobbelte densitetsgradientcentrifugering rutinemæssigt giver 150 ± 40 x 10 6 monocytter som kan differentieres på 70 ± 30 x 10 6 makrofager (figur 2) pr buffy coat. Den gennemsnitlige makrofag udbytte fra20 uafhængige præparater var 47 ± 14% af den samlede isolerede monocytter. Efter Percoll gradientcentrifugering kan der stadig være nogle resterende ikke-monocytiske celler til stede i præparatet, der er afhængig af bloddonor samt på nøjagtigheden af ​​fremgangsmåden til isolering. Men efter differentiering fase af 6-7 dage, forberedelse består hovedsageligt af modne makrofager (figur 3), som kan beriges yderligere på grund af deres tilslutning til plastoverflader, en funktion, der ikke deles af de tilfældige kontaminerende celler (figur 4A og B). Når belagt, størstedelen af makrofager viser en klassisk &quot;spejlæg&quot; morfologi, mens der også celler med en strakt spindel-lignende fænotype (figur 4C og D). Dette afspejles af deres F-actin fordeling i cytoplasmaet og vedhæftning klynger. De differentierede cellerer kendetegnet ved ekspression af CD45, CD14, CD16, CD206 (mannosereceptor), CD11b og CD11c som er typiske markører for modne makrofager (figur 5). Tilstedeværelsen af ​​CD11 taler imod en overvejende dendritisk differentiering, som er understøttet af det faktum, at cellerne er negative for den dendritiske celle markør CD209 (DC-SIGN). Efter differentieringsprocessen cellerne forbliver funktionelt og metabolisk aktive i cirka 5-7 dage (figur 6), som det kan være visualiseret ved calcein AM farvning og deres evne til at optage ekstracellulære vesikler kaste fra tumorceller. Derudover kan cellerne stadig aktiveres som vist fx til stimulering med lipopolysaccharid (LPS), som resulterer i ekspression af flere pro-inflammatoriske gener (figur 7). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ filer / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figur 1. Udseende og sammensætningen af PBMC- og monocyt-lag efter dobbelt densitetsgradientcentrifugering. Fotografi, der illustrerer (A) PBMC-band efter Ficoll gradient og (D) monocytten fase efter isoosmotisk Percoll- centrifugering. May-Gruenwald farvninger af cytospinpræparater for (B, C) ​​PBMC fraktion og de ​​resterende (E, F) monocytter. Skala bar = 200 um i B og E, = 50 um i C og F. <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figur 2. Udbytte af monocytter og makrofager. Repræsentative celle tællinger af isolerede monocytter og makrofager 20 fibrinlag preparations. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figur 3. Mikrografer og cellestørrelse målinger af monocytter og makrofager. Fasekontrastmikroskopi af monocytisk cellesuspension før (A) og efter (B) makrofag differentiering. Tilsvarende cellestørrelse histogrammer for monocytter (C) og makrofager (D). Målestok = 100 um. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figur 4. Morfologi og cytoskeletale organisering af adhærente makrofager. Fasekontrastmikroskopi af adhærente makrofager før (A) og efter (B) fjernelse af ikke-adherenT-celler. (C, D) phalloidin-TRITC farvning af filamentøse actin i adhærerende, ikke-stimulerede makrofager. Skala bar = 100 um i AC, 20 um i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5. immunofænotype af differentierede makrofager. Flowcytometrianalyse af makrofager efter 6 dages differentiering i FEP teflonbeklædte cellekultur poser (angivet i rødt). De tilsvarende isotypekontroller er vist i gråt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Figur 6. Optagelse af tumor celle mikrovesikler af makrofager. Mikrografer af vedhængende makrofager efter redegørelsen til PKH26-mærkede (røde fluorescerende) tumor celleafledte mikrovesikler. Billeder overlejres til den tilsvarende (A) lysfelt eller (B) cytosolisk farvning med levedygtighed farvestof calcein AM. Skalapanelerne = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Opregulering af IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7 og MT1-MMP efter stimuning af makrofager med LPS (100 ng / ml) i 24 timer. Genekspression blev målt ved kvantitativ RT-PCR fra samlet RNA-prøver (A) og normaliseret på HPRT1 og GNB2L1 ekspression. De viste værdier er fold ændringer i forhold til den ubehandlede kontrol (middel ± SD, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa og IL-6-induktion under LPS-stimulering blev yderligere bekræftet ved ELISA (B) (middel ± SD, * p &lt;0,05).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Vi præsenterer en enkel og effektiv protokol til generering af humane makrofager. Buffy coats behandles af dobbelt densitetsgradientcentrifugering og isolerede monocytter derefter differentieres til makrofager i teflonbelagte cellekultur poser. Dette maksimerer makrofag udbytter og letter cellehøst til efterfølgende eksperimenter.

Isolering af humanmonocytter af Double Gradient centrifugering og deres differentiering til makrofager i teflonbelagte Cell Culture Tasker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering og Th17 Differentiering af Naïve CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Stærkt Effektiv Transfektion af menneskelige THP-1 makrofager ved nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In vitro Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging af antifungal aktivitet af humane primære neutrofiler og monocytter i Reaktion på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Induceret differentiering af M celle-lignende celler i humane stamcelle-afledte ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...