Name: isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Майке Schaffrinski для ее всегда отличной технической помощи в течение последних нескольких лет. Эта работа финансировалась через Немецкого научно-исследовательского совета (DFG) в рамках совместных исследований группы 942 (FOR942) и Программой научно-исследовательского факультета медицины, Георг-Августа-университета Геттингена.

1 приготовления стерильных сыворотки АВ человека <ol><li> Отобрать 4-5 мешков свежезамороженной плазмы (СЗП). Магазин мешков при -20 ° С до тех пор, пока достаточное количество мешков были собраны. </li><li> Оттепель мешки и инкубируют в течение 30 мин при 56 ° С на водяной бане для инактивации комплемента и удаления фибрина. </li><li> Тщательно продезинфицируйте вне мешки и перенести плазму 50 мл пробирок. </li><li> Центрифуга на 3000 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы избавиться от выделений и остаточных тромбоцитов. </li><li> Бассейн все супернатантами и отбросить гранул. </li><li> Образцы Алиготе сыворотки в 15 мл пробирки и хранят при температуре -20 ° C. Примечание: В качестве альтернативы, можно использовать коммерчески доступные термически инактивированной нормальной человеческой сыворотки АВ. </li></ol> 2 Выделение моноцитов Для облегчения балансировки центрифуги, рекомендуется, чтобы обрабатывать два лейкоцитарных пленок параллельно. Тем не менее, принять окповторно использовать отдельные материалы для каждого донора, а не смешивать клетки. В случае лейкоцитарных пленок не могут быть получены легко, 400 мл гепаринизированной периферической крови может быть использован вместо. <ol><li> Тщательно продезинфицируйте пластиковые пакеты, содержащие Баффи пальто и переместите содержимое каждого лейкоцитарной пленки для двух 50 мл пробирок. </li><li> Для каждого лейкоцитарной пленки заполнить три 50 мл пробирки с 15 мл раствора Ficoll (1,077 г / мл). Ficoll должна быть при комнатной температуре в течение препарата. </li><li> Слой 30-35 мл и светлый сгусток крови в верхней части раствора Ficoll для первого градиента плотности. Будьте осторожны, чтобы сделать это медленно и осторожно, чтобы не допустить смешивания обоих слоев. </li><li> Центрифуга при 400 мкг в без тормоза в течение 30 мин при комнатной температуре. </li><li> Для каждого градиента собирают белое кольцо из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), который расположен между двумя фазами с пластиковой пипетки Пастера и переносят в 50 мл пробирку. </li><li> Заполните каждую трубку с PBS-EDTA (1 мМ) до 40 мл в общей сложности. </li><li> Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин без тормоза при комнатной температуре. </li><li> Аспирируйте супернатант и осадок снова мыть с 40 мл PBS-EDTA (1 мМ). </li><li> Для каждого пула доноров гранулы в 20 мл RPMI-1640 без фенола красного + 10% FCS. </li><li> Подготовьте ISO-осмотическое Перколла решение для второй градиента плотности: Для двух доноров смешать 23,13 мл раствора Перколла (плотность 1,131 г / мл) в 50 мл пробирку с 1,87 мл 10 раз PBS. Затем передать 23 мл этого раствора в новую пробирку на 50 мл и добавляют 27 мл среды RPMI-1640 с фенолом красный + 10% FCS, чтобы получить 46% ISO-осмотическое решение Перколла. Перколла должна быть при комнатной температуре в течение препарата. </li><li> Для каждой передачи доноров 25 мл приготовленного раствора Перколла к 50 мл трубки и слой раствора РВМС подготовленный в 2,9) в верхней части решения Перколла. Будьте осторожны, чтобы сделать это очень медленноD тщательно, оба слоя, как правило, легко смешивать. Если все сделано правильно две фазы могут быть выделены в силу их разницы в цвете. </li><li> Центрифуга при 550 мкг в без тормоза в течение 30 мин при комнатной температуре. </li><li> Для каждого градиента собирают белое кольцо моноцитов, который расположен между двумя фазами с пластиковой пипетки Пастера и переносят в 50 мл пробирку. </li><li> Заполните каждую трубку с PBS-EDTA (1 мМ) до 50 мл в общей сложности. </li><li> Центрифуга при 400 мкг в течение 10 мин без тормоза при комнатной температуре. </li><li> Аспирируйте супернатант и ресуспендируют гранул в 20 мл RPMI-1640 с фенол красный + 10% FCS. </li></ol> 3 Дифференциация моноцитов в макрофаги <ol><li> Определить количество изолированных моноцитов в разведении 1:10 в трипанового синего. Только подсчет большие, часто неправильной формы клетки, которые моноциты. Не рассчитывайте меньшие, круглые формы клеток, которые лимфоциты. NПРИМЕЧАНИЕ: цифры моноцитов не должны быть определены слишком точно, потому что они только заикнуться о том, сколько и какие FEP тефлоновым покрытием сумки (малые или большие) должны быть использованы для дифференцировки клеток. </li><li> Для 1,0-1,5 х 10 8 моноцитов из одного донора, семян клетки в большом FEP с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешок. Для каждого мешка подготовить культуральной среды, состоящий из 174 мл среды RPMI-1640, 2% человеческой АВ сыворотки (полученного в разделе 1), 1% пенициллина / стрептомицина, и 2,5 нг / мл M-CSF (общий объем: 180 мл). <ol><li> Для 3.0-5.0 х 10 7 моноцитов от одного донора, семена клетки в небольшом тефлоновым покрытием мешок для культивирования клеток. Для каждого мешка подготовки культуральной среды, состоящей из 28,5 мл RPMI-1640, 2% человеческой АВ сыворотки (полученного в разделе 1), 1% пенициллина / стрептомицина, и 2,5 нг / мл M-CSF (общий объем: 30 мл). ПРИМЕЧАНИЕ: Если например, 8,0 х 10 7 моноциты получаются, мы рекомендуем, чтобы семя их в TWуплотнительные меньшие сумки объемные с 4,0 х 10 7 клеток в каждой. Вместо того, чтобы M-CSF, моноциты, альтернативно, могут быть дифференцированы с гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) при той же концентрации (2,5 нг / мл). </li></ol></li><li> Добавить клеточной суспензии (20 мл) на подготовленную среду и тщательно перемешать. Если два мешка получают из одного донора, добавьте 20 мл RPMI-1640 к клеточной суспензии, а затем добавить половину суспензии к каждому средней подготовки. </li><li> Дополнительно: Для того, чтобы определить, является ли препарат моноцитов остается стерильной, оторвать одну каплю суспензии клеток на кровяным агаром и инкубировали в течение ночи при 37 ° С. </li><li> Затянуть оболочку 50 мл Perfusor шприца на клеммы FEP с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешок и заполнить его с приготовленной суспензии клеток. </li><li> Отключите шприц и нажмите оставшийся воздух из мешка. Закройте мешок с закрытия конуса. </li><li> Выдержите сумки в течение 6-7 дней при 3776; C с 5% CO 2. </li></ol> 4 макрофагов Harvest <ol><li> Поместите FEP тефлоновым покрытием клеточных культур сумки с дифференцированной макрофагов на льду в течение не менее 1 часа, чтобы облегчить отряд клеток (инкубационный до 3 часов можно). Убедитесь, что вся поверхность мешка покрыта льдом. </li><li> Потяните сумку с минимальным давлением 10x над краем столе / доске. </li><li> Тщательно продезинфицируйте пределами упаковки и удалите закрытия конус. </li><li> Затянуть 50 мл шприц на клеммы пакета, удалите клеточной суспензии, и перенести его на 50 мл пробирки. </li><li> Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы вращаться вниз клетки. </li><li> Аспирируйте супернатант и объединить гранул из одного мешка в 10 мл RPMI-1640 + 10% FCS в общей сложности. </li><li> Определить количество клеток в гемоцитометре (1: 4-1: 10 разведение в трипанового синего). Только сосчитать большие круглые клетки. ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференциации макрофагов в мешках на FEP с тефлоновым покрытием, могут быть остаточные клетки, например, лимфоциты, в зависимости от донора и от качества изоляции моноцитов. </li><li> Для повторного использования мешков с FEP с тефлоновым покрытием, мыть их дважды 70% этанолом для удаления остаточных клеток. Заполните их с помощью 50 мл 70% этанола и инкубировать в течение ночи. Промыть мешки 3x стерильной PBS, завернуть их в бумагу стерилизации, и стерилизуют в автоклаве с использованием стандартных процедур. ПРИМЕЧАНИЕ: культуры клеток мешки могут быть повторно использованы несколько раз без потери урожайности макрофагов. Тем не менее, мы решили отказаться от сумки после 10 использует прежде чем они начинают протекать. </li><li> Для последующих экспериментах культуры макрофагов в среде RPMI-1640 + 10% FCS. Если более низкие концентрации в сыворотке требуются, культивирование в среде RPMI-1640 с добавлением 1% FCS также возможно. Семя и инкубировать клетки для 3-4 ч. После этого периода, отметим, что макрофаги приложить к поверхности клетки культуральной чашке времялюбые загрязняющие клетки (т.е. эритроциты, лимфоциты и дендритные клетки) остаться в суспензии. Промыть клетки, по крайней мере в два раза с PBS, чтобы удалить неприкрепленных клеток. </li><li> Чтобы отсоединить культивируемые макрофаги из клеточной культуры блюдо для дальнейших экспериментов, тщательно очистить их от поверхности. Кроме того, инкубировать блюда в течение 20 мин на льду, аспирация культуральной среды, и добавить 1 мл фермента без диссоциации клеток буфер. После 5 мин инкубации при 37 ° С, добавить 4 мл PBS, и отделить клетки пипетированием вверх и вниз, по крайней мере, 3 мин. </li></ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать как никакого конфликта интересов не существует.

Макрофаги являются важными эффекторными клетками врожденной иммунной системы и отображать важные функции в иммуномодуляции, презентации антигена и тканевого гомеостаза. Благодаря своей замечательной пластичности, они способны реагировать на различные стимулы с изменением их фенотипа. Тем не менее, до сих пор много данных о макрофагов поляризации получаются в мышиной системы, хотя есть отчеты, показывающие, что только около 50% из макрофагов маркеров поляризационных могут быть непосредственно переведены из мыши с человеческим 16. Таким образом, мы приводим здесь метод получения первичных человеческих макрофагов в достаточном количестве и чистоты без необходимости в дорогостоящих материалов, например, Mac магнитных шариков или противотока центробежной сепарации устройства. Метод основан на выделении моноцитов из РВМС и их последующей дифференциации в макрофагах в FEP с тефлоновым покрытием клеточных культур мешки в присутствии низкой Concentrations из M-CSF 11-13. В то время как моноциты составляют менее 5 до 10% лейкоцитов периферической крови в организме человека, при стимуляции их вербовали в периферийных участках, где они дифференцируются в резидентных макрофагов тканей или дендритных клеток 17. Цитокин M-CSF имеет важное значение для выживания моноцитов и приводит их дифференцировку в макрофаги 18,19. Пока концентрация M-CSF, которые были выбраны для моноцитов дифференциации варьировались до 100 нг / мл, однако, в нашем протоколе мы можем получить достаточное количество зрелых макрофагов с концентрацией M-CSF лишь 2,5 нг / мл 12 , 20. Кроме того, клетки культивируют в ФЭП с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешки, которые облегчают отделение макрофагов и их последующего посева в определенных количества клеток. Поскольку пакеты могут быть использованы несколько раз, это дальнейшее сокращение расходов на процессе выделения. Макрофаги, полученные по этой методикевесьма позитивным для CD45, CD14, CD11b, CD11c и показать экспрессию рецептора маннозы CD206, который утверждает, что в стране проживает чистых, зрелых макрофагов 21,22. Особенно высокий уровень экспрессии CD14 является типичным для макрофагов дифференцированных в присутствии M-CSF 23. После посева клеток, они показывают быстрый приверженность пластиковых поверхностей с некоторых клеток с типичной шпинделя морфологию, а другие проявляют жареную фенотип яйца. Это в соответствии с замечаниями от других авторов 18,22,24. Было сообщено, что моноциты дифференциация в присутствии M-CSF приводит к M2-поляризованных макрофагов 16,25. Тем не менее, макрофаги, изолированные от нашего протокола все еще ​​способны реагировать на широкий круг раздражителей, включая воздействие клеток, полученных микропузырьков опухолевых и совместного культивирования с опухолевыми клетками или 26,27 воздействием ЛПС, к которым они вступают в реакцию с индукцией про- воспалительные гены, такие как IL-1 и# 946 ;, ФНО, Wnt5a, или различные матричные металлопротеиназы, которые считаются типичными для M1-поляризованных макрофагов 3,5,28. В заключение, выделение моноцитов по двойным центрифугированием в градиенте плотности и последующей дифференциации в направлении макрофагов в ФЭП с тефлоновым покрытием для культивирования клеток сумки приводит к большим числом макрофагов без необходимости технически трудно или дорого процедур. Полученные макрофаги могут быть использованы для последующего анализа, начиная от классической активации через ЛПС в совместной культуре с опухолевыми клетками.

Клетки из моноцитов линии и их терминально дифференцированных производных - макрофаги - проявляют поразительное пластичность в отношении их биологической функции, что приводит к их участия в таких разнообразных процессов, как развитие, восстановления тканей, и иммунитета 1. Последнее связано с их фагоцитарной и антигенпрезентирующей способности, которые ставит макрофаги на перекрестке между врожденной и адаптивной иммунной реакции 2. Тем не менее, их способность к секреции цитокинов, хемокинов, факторов роста и другие сигнальные молекулы 1 не только увеличивает свою функцию иммунной модулирующее, но также служит в качестве основы для их дополнительными функциями. Попытки отразить эти разнообразные шаги активации в контексте не-микробных опосредованных условий привели к категории М1 и М2 3. Хотя эта классификация не является полной, она позволяет базового понимания макрофагов биологии. В связи с этим многогранных возможностей это неудивительно, что макрофаги, связанной со многими условиями, которые в некотором роде вовлечено ремоделирование тканей или воспаление. Рядом с их фундаментальной роли в признании и оформления вторжения патогенов 4-6, макрофаги все чаще в центре внимания в атеросклероз, фиброз, ожирения и рака 7-10. Воспроизводимый метод для генерации человеческих макрофагах Поэтому крайне важно для понимания этих патологий. Здесь мы представляем метод, основанный на выделении человеческих моноцитов из периферической крови здоровых доноров по методике двойной градиент плотности центрифугирования, как описано выше 11. Для того чтобы облегчить дифференцировку макрофагов в сторону, изолированные моноцитов клетки инкубируют в присутствии низких концентраций M-CSF и нормальной сыворотке человека 12. Чтобы облегчить дальнейшее обращение и урожай клеток, дифференцировка осуществляется в газопроницаемых FEPС тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешки с гидрофобной поверхности 12-15. Полученные отдыха макрофаги могут быть подвергнуты широком диапазоне анализов, как они все еще способны реагировать либо в моде М1 или М2-типа. Альтернативные методы выделения моноцитов и последующей дифференциации, такие как магнитный сортировка клеток (MACS) или противоточных центробежный вынос (CCE) имеют некоторые ограничения относительно урожайности, стоимость и время, необходимое. Протокол описано здесь имеет то преимущество, что она может быть осуществлено с помощью стандартного лабораторного оборудования без необходимости в специальных реагентов (например, MACS магнитных шариков) или устройств (например, CCE аппаратуры) и учитывает при обработке больших количеств клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Человека макрофаги участвуют в многочисленных патологических процессов, начиная от инфекционных заболеваний к раку. Таким образом, они представляют собой ценный инструмент, чтобы понять основные механизмы этих заболеваний. Поэтому мы представляем простой протокол для выделения человеческих моноцитов из лейкоцитарных пленок, а затем с помощью процедуры дифференциации, что приводит к высоким выходам макрофагов. Эта технология основана главным образом на общедоступных лабораторного оборудования и, таким образом, представляет собой экономически и времени эффективный способ получения больших количеств человеческих макрофагах. Вкратце, лейкоцитарных пленок от здоровых доноров крови, подвергают двойной центрифугированием в градиенте плотности для сбора моноцитов из периферической крови. Эти моноциты культивировали в то фторированных этилен-пропилен (ФЭП) с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешков в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF). Дифференцированные макрофаги могут быть легко собирать и использовать для последующих исследований и функциональным,говорит. Важные методы контроля качества и проверки достоверности выделения и дифференциации шагов будут выделены в рамках протокола. Таким образом, протокол, описанный здесь позволяет ученым регулярно и воспроизводимо изолировать человека макрофаги без необходимости дорогостоящего инструмента. Более того, модели болезни могут быть изучены в сингенных человеческой системы в обход использование мышиных макрофагов.

Первый центрифугирования в градиенте плотности с использованием Ficoll дает белый интерфазу содержащий МНПК (Рисунок 1A) т.е. лимфоциты и моноциты. Это может быть подтверждено через окрашивания мая-Gruenwald (Цифры 1B и C) из собранных клеток, который показывает как высокую ядра / соотношение цитоплазмы (типичных лимфоцитов) и bean- или кольцеобразные ядра (типичный моноцитов). Когда эти клетки затем загружали на втором градиенте плотности с использованием Перколла, моноциты могут быть далее отделена от лимфоцитов и снова появляется в виде белого интерфазы (Фигуры 1D-F). Для каждого лейкоцитарной пленки описано дважды градиент плотности центрифугирования обычно дает 150 ± 40 х 10 6 моноциты, которые могут быть дифференцированы в 70 ± 30 х 10 6 макрофагов (рисунок 2) в лейкоцитарной пленки. Средний макрофагов выход из20 независимых препараты был 47 ± 14% от общего объема выделенных моноцитов. После центрифугирования в градиенте Перколла там еще может быть некоторое количество остаточных моноцитарные клетки, присутствующие в подготовке, которая зависит от донора крови, а также от точности в процессе выделения. Тем не менее, после дифференцирования фазы 6-7 дней, подготовка в основном состоит из зрелых макрофагов (рисунок 3), которые могут быть дополнительно обогащенных за их соблюдением пластиковых поверхностей, особенность, которая не разделяет случайных загрязняющих клеток (Рисунки 4A и В). После покрытием, большинство из макрофагов показать классическое &quot;жареным яйцом&quot; морфологию, а есть и клетки с растягивается шпинделя как фенотипа (рис 4 ° С и D). Это отражается на их F-актин распределения в цитоплазме и адгезии кластеров. Дифференцированные клеткихарактеризуются выражением CD45, CD14, CD16, CD206 (манноза рецепторов), CD11b и CD11c, характерные маркеры для зрелых макрофагов (рисунок 5). Наличие CD11b выступает против преимущественно дендритных дифференциации, которая опирается на тот факт, что клетки отрицательны для дендритных клеток маркера CD209 (DC-SIGN). После процесса дифференцировки клетки остаются функционально и метаболически активными в течение примерно 5-7 дней (рисунок 6), как это может быть, визуализированных с помощью Кальцеин AM окрашивание и их способность поглощать внеклеточных пузырьки пролить от опухолевых клеток. Кроме того, клетки все еще ​​могут быть активированы, как показано, например, на стимуляции липополисахаридом (ЛПС), что приводит к экспрессии нескольких провоспалительных генов (фиг.7). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in"SRC = &quot;/ файлы / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; ширина = &quot;500&quot; /&gt; Рис.1 Внешний вид и состав PBMC- и моноцитов-слой после градиента двойной плотности центрифугирования. Фотографию, иллюстрирующую (A) РВМС-группу после градиента Фиколла и (D) моноцитов-фазы после изо-осмотическое Перколла центрифугирования. Май-Gruenwald окрашивание из цитоспиновых препаратов (B, C) ​​ОКПК фракции, а остальные (E, F) моноцитов. Шкала бар = 200 мкм в В и Е, = 50 мкм в С и F. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Рисунок 2 Доходность моноцитов и макрофагов. Представительства сотовые Подсчеты изолированных моноцитов и макрофагов из 20 поглощающее покрытие прeparations. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Рис.3 Микрофотографии и измерения размеров клеток из моноцитов и макрофагов. Фаза контрастной микроскопии моноцитарных клеточной суспензии до (А) и после (б) макрофагов дифференциации. Соответствующий размер ячейки гистограммы моноцитов (C) и макрофагов (D). Шкала бар = 100 мкм. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Рисунок 4 Морфология и организации цитоскелета прилипающих КПЭ. Фаза контрастной микроскопии прилипающих КПЭ до (А) и после (Б) удаление не-adherenТ-клетки. (С, D) фаллоидином-TRITC окрашивание нитчатых актина в адгезивных, нестимулированных макрофагов. Шкала бар = 100 мкм в УК, 20 мкм в D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Рисунок 5 Иммунофенотип дифференцированных макрофагах. Проточной цитометрии анализа макрофагов после 6 дней дифференциации в FEP с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешки (обозначена красным). Соответствующие управления изотипные выделены серым цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Рисунок 6 Поглощение опухолевых клеток микровезикул макрофагами. Микрофотографии прилипшие макрофагов после экспозиции к PKH26-меченых клеток, полученных микровезикул (красный флуоресцентный) опухолей. Изображения накладывается на соответствующий (A) светлого или (б) цитозольного окрашивания с красителем кальцеина AM жизнеспособности. Шкала баров = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Рисунок 7 Повышающая регуляция IL-1 β, Wnt5a, TNF, IL-6, ММР-2, ММР-7, и МТ1-ММР после stimuтельства макрофагов с LPS (100 нг / мл) для выражения 24 часов. Gene была измерена с помощью количественной ОТ-ПЦР из общей РНК образцов (А) и нормированы на HPRT1 и GNB2L1 экспрессии. Указанные значения представляют собой складки изменения в сравнении с необработанным контролем (значит ± SD, п = 5, * р &lt;0,05, ** р &lt;0,01, *** р &lt;0,001). ФНО и ИЛ-6 индукции под стимуляции ЛПС были дополнительно подтверждены ELISA (B) (среднее значение ± SD, * р &lt;0,05).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Мы предлагаем простое и эффективный протокол для генерации человеческих макрофагах. Лейкоцитарных пленок обрабатываются с помощью двойного центрифугирования в градиенте плотности и изолированные моноциты затем дифференцируются в макрофаги в тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешков. Это максимизирует доходность макрофагов и способствует сбор клеток для последующих экспериментов.

Выделение моноцитов человека, дважды градиентного центрифугирования и их дифференциации с макрофагами в тефлоновым покрытием культуре клеток Сумки

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Индуцированная дифференциация M-клеточных клеток в стволовой клетке человека производные Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...