Name: isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00
Duration: 9 min 32 s
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Los autores desean agradecer a la señora Meike Schaffrinski por su siempre excelente asistencia técnica durante los últimos años. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Alemana (DFG) dentro del grupo de investigación conjunta 942 (FOR942) y por el Programa de Investigación de la Facultad de Medicina de la Georg-August-Universität Göttingen.

1 Preparación de suero AB humano estéril <ol><li> Recoger 4-5 bolsas de plasma fresco congelado (FFP). Hasta que se hayan recogido las bolsas de las tiendas a -20 ° C suficientes bolsas. </li><li> Descongele las bolsas y se incuba durante 30 min a 56 ° C en un baño de agua para inactivar el complemento y eliminar la fibrina. </li><li> Desinfectar bien el exterior de las bolsas y transferir el plasma a tubos de 50 ml. </li><li> Se centrifuga a 3.000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente para deshacerse de precipitados y plaquetas residuales. </li><li> Piscina todo sobrenadantes y deseche los pellets. </li><li> Muestras de suero alícuota en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C. NOTA: Alternativamente, disponible comercialmente normal de suero AB humano inactivado por calor puede ser utilizado. </li></ol> 2. Aislamiento de monocitos Para facilitar el equilibrio de la centrífuga, se recomienda procesar dos capas leucocitarias en paralelo. Sin embargo, tomar cavolver a utilizar materiales separados para cada donante y no mezclar las células. En el caso de capas leucocitarias no se pueden obtener fácilmente, 400 ml de sangre periférica heparinizada se pueden utilizar en su lugar. <ol><li> Desinfectar con cuidado las bolsas de plástico que contienen las capas leucocitarias y transferir el contenido de cada capa leucocitaria de dos tubos de 50 ml. </li><li> Para cada capa leucocitaria llenar tres tubos de 50 ml con 15 ml de solución de Ficoll (1,077 g / ml). El Ficoll debe estar a temperatura ambiente para la preparación. </li><li> Capa de 30-35 ml de la capa leucocitaria de sangre en la parte superior de la solución de Ficoll para la primera gradiente de densidad. Tenga cuidado al hacer esto lentamente y con cuidado a fin de evitar que se mezclen ambas capas. </li><li> Centrifugar a 400 xg sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recoger el anillo blanco de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) que está situado entre las dos fases con una pipeta Pasteur de plástico y la transferencia a un tubo de 50 ml. </li><li> Llenar cada tubo con PBS-EDTA (1 mM) hasta 40 ml en total. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar pellet de nuevo con 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Para cada grupo de donantes los gránulos en 20 ml de RPMI-1640 sin rojo de fenol + 10% de FCS. </li><li> Preparar la solución de Percoll iso-osmótica para el segundo gradiente de densidad: Para dos donantes mezclan 23,13 ml de solución de Percoll (densidad: 1,131 g / ml) en un tubo de 50 ml con 1,87 ml de PBS 10 veces. A continuación, transferir 23 ml de esta solución a un nuevo tubo de 50 ml y añadir 27 ml de RPMI-1640 con rojo fenol + FCS al 10% para obtener una solución 46% de Percoll iso-osmótica. El Percoll debe estar a temperatura ambiente para la preparación. </li><li> Para cada donante de transferencia de 25 ml de la solución de Percoll preparada a un tubo de 50 ml y la capa de la solución de PBMC preparado en 2.9) en la parte superior de la solución de Percoll. Tenga cuidado al hacer esto muy lentamente unad cuidadosamente, ambas capas tienden a mezclarse fácilmente. Si se hace correctamente las dos fases se pueden distinguir debido a su diferencia en el color. </li><li> Centrifugar a 550 xg sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recoger el anillo blanco de los monocitos que se encuentra entre las dos fases con una pipeta Pasteur de plástico y la transferencia a un tubo de 50 ml. </li><li> Llenar cada tubo con PBS-EDTA (1 mM) hasta 50 ml en total. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 20 ml de RPMI-1640 con rojo fenol + 10% de FCS. </li></ol> 3. diferenciación de los monocitos a macrófagos <ol><li> Determinar el número de monocitos aislados en una dilución 1:10 en azul de tripano. Sólo contar las células grandes, a menudo de forma irregular-, que son los monocitos. No contar las células pequeñas, con forma redonda que son linfocitos. NOTA: Los números de monocitos no se han determinado con precisión demasiado porque sólo dan una pista acerca de cuántos y cuáles recubierto de teflón FEP bolsas (pequeños o grandes) tienen que ser utilizados para la diferenciación de las células. </li><li> Para 1,0-1,5 x 10 8 monocitos a partir de un donante, sembrar las células en una gran bolsa de cultivo celular recubierto de teflón FEP. Para cada bolsa de preparar el medio de cultivo que consiste en 174 ml de RPMI-1640, 2% de suero AB humano (como se ha preparado en la Sección 1), 1% de penicilina / estreptomicina, y 2,5 ng / ml de M-CSF (volumen total: 180 ml). <ol><li> Para 3,0-5,0 x 10 7 monocitos a partir de un donante, sembrar las células en una pequeña bolsa de cultivo celular recubierto de teflón. Para cada bolsa de preparar el medio de cultivo que consiste en 28,5 ml de RPMI-1640, 2% de suero AB humano (como se ha preparado en la Sección 1), 1% de penicilina / estreptomicina, y 2,5 ng / ml de M-CSF (volumen total: 30 ml). NOTA: Si por ejemplo, se obtienen 8,0 x 10 7 monocitos, se recomienda sembrar en two bolsas de menor volumen con 4,0 x 10 7 células cada uno. En lugar de M-CSF, monocitos, alternativamente, se pueden diferenciar con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) a la misma concentración (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Añadir la suspensión celular (20 ml) al medio preparado y mezclar cuidadosamente. Si dos bolsas se preparan a partir de un donante, añadir 20 ml de RPMI-1640 a la suspensión celular y a continuación, añadir la mitad de la suspensión a cada preparación de medio. </li><li> Opcional: Para determinar si la preparación de los monocitos se ha mantenido estéril, al desgarro de una gota de la suspensión de células en una placa de agar sangre e incubar durante la noche a 37 ° C. </li><li> Apriete la vaina de un 50 ml PERFUSOR jeringa en el tapón de la bolsa de cultivo celular recubierto de teflón FEP y llenarlo con la suspensión celular preparada. </li><li> Desconecte la jeringa y empuje el aire que queda fuera de la bolsa. Cierre la bolsa con un cono de cierre. </li><li> Incubar las bolsas durante 6-7 días a 3776; C con 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrófagos Harvest <ol><li> Coloque las bolsas recubiertas de Teflon FEP cultivo celular con los macrófagos diferenciados en hielo durante al menos 1 hora para facilitar el desprendimiento de las células (una incubación de hasta 3 horas es posible). Asegúrese de que toda la superficie de la bolsa está cubierto de hielo. </li><li> Tire de la bolsa con una presión mínima de 10x sobre el borde de una mesa / tabla. </li><li> Desinfectar cuidadosamente el exterior de la bolsa y retire el cono de cierre. </li><li> Apretar una jeringa de 50 ml en el enchufe de la bolsa, retire la suspensión de células, y la transfiere a tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente para de girar las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y poner en común las pastillas de una bolsa de 10 ml de RPMI-1640 + 10% FCS en total. </li><li> Determinar el número de células en un hemocitómetro (1: 4-1: 10 de dilución en azul de tripano). Sólo contar las grandes células redondas. NOTA: Después de la diferenciación de los macrófagos en las bolsas recubiertas con Teflon FEP, no puede haber células residuales, por ejemplo, linfocitos, dependiendo del donante y de la calidad del aislamiento de monocitos. </li><li> Para reutilizar las bolsas recubiertos con teflón FEP, lavar dos veces con etanol al 70% para eliminar las células residuales. Llene con 50 ml de etanol al 70% y se incuba durante la noche. Lavar las bolsas 3 veces con PBS estéril, se envuelven en papel de esterilización, y esterilizar en un autoclave utilizando procedimientos estándar. NOTA: Las bolsas de cultivo celular se pueden reutilizar varias veces sin ninguna pérdida en los rendimientos de los macrófagos. Sin embargo, decidimos desechar las bolsas después de 10 usos antes de que empiecen a gotear. </li><li> Para posteriores experimentos de cultivo de macrófagos en RPMI-1640 + 10% de FCS. Si se requieren menores concentraciones de suero, el cultivo en medio RPMI-1640 con 1% de FCS también es posible. Semillas y células Incubar durante 3-4 horas. Después de este período, tenga en cuenta que los macrófagos se adhieren a la superficie del cultivo celular plato mientrasningún células contaminantes (es decir eritrocitos, linfocitos y células dendríticas) permanecen en suspensión. Lavar las células al menos dos veces con PBS para eliminar las células no adherentes. </li><li> Para separar macrófagos cultivados a partir de la placa de cultivo de células para experimentos adicionales, raspar cuidadosamente de la superficie. Alternativamente, se incuban los platos durante 20 min en hielo, aspirar el medio de cultivo, y añadir tampón de disociación celular libre de enzimas 1 ml. Después de 5 min de incubación a 37 ° C, añadir 4 ml de PBS, y separar las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo durante al menos 3 min. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar que no existe conflicto de intereses.

Los macrófagos son importantes las células efectoras del sistema inmune innato y muestran funciones importantes en la inmunomodulación, la presentación de antígenos y la homeostasis del tejido. Debido a su notable plasticidad, que son capaces de responder a diferentes estímulos con los cambios de su fenotipo. Sin embargo, se obtienen hasta ahora una gran cantidad de datos con respecto a la polarización de los macrófagos en el sistema murino, aunque hay informes que muestran que sólo alrededor del 50% de los marcadores de polarización de macrófagos puede ser traducido directamente del ratón a humano 16. Por lo tanto, se presenta aquí un método para obtener los macrófagos humanos primarios en número y en pureza suficiente sin la necesidad de materiales costosos, por ejemplo, perlas magnéticas MACS o un dispositivo de elutriación centrífuga a contracorriente. Nuestro método se basa en el aislamiento de monocitos a partir de PBMCs y su posterior diferenciación a los macrófagos en FEP recubierto de teflón bolsas de cultivo celular en presencia de bajo concentrations de M-CSF 11-13. Mientras que los monocitos representan menos del 5 al 10% de los leucocitos de sangre periférica en los seres humanos, tras la estimulación que son reclutados a los sitios periféricos donde se diferencian a macrófagos tisulares residentes o células dendríticas 17. La citoquina M-CSF es importante para la supervivencia de monocitos y acciona su diferenciación a los macrófagos 18,19. Hasta el momento, las concentraciones de M-CSF que fueron elegidos para la diferenciación de los monocitos variaban hasta 100 ng / ml, sin embargo, en nuestro protocolo somos capaces de obtener un número suficiente de macrófagos maduros con una concentración de M-CSF de sólo 2,5 ng / ml 12 , 20. Además, las células se cultivan en bolsas recubiertas de Teflon FEP de cultivo celular que facilitan el desprendimiento de los macrófagos y su posterior siembra en el número de células definidas. Dado que las bolsas se pueden reutilizar varias veces, esto disminuye aún más los costes para el proceso de aislamiento. Los macrófagos obtenidos por este procedimientoson altamente positivos para CD45, CD14, CD11b, CD11c y mostrar expresión del CD206 receptor de manosa que argumenta a favor de una población de, macrófagos maduros puros 21,22. Especialmente alta expresión de CD14 es típico para los macrófagos diferenciados en presencia de M-CSF 23. Después de la siembra de las células, muestran una adhesión rápida a las superficies de plástico con algunas células que muestran una morfología típica de tipo huso, mientras que otros exhiben un fenotipo huevo frito. Esto está de acuerdo con las observaciones de otros autores 18,22,24. Se informó de que la diferenciación de monocitos en presencia de M-CSF conduce a macrófagos polarizadas-M2 16,25. Sin embargo, los macrófagos aislados por nuestro protocolo todavía son capaces de responder a una amplia gama de estímulos incluyendo la exposición a microvesículas derivados de células tumorales y co-cultivo con células tumorales 26,27 o la exposición a LPS a los que reaccionan con la inducción de pro genes inflamatorios tales como IL-1 y# 946 ;, TNFa, Wnt5a o varias metaloproteinasas de la matriz que se consideran típicos de macrófagos polarizadas-M1 3,5,28. En conclusión, el aislamiento de monocitos por doble centrifugación en gradiente de densidad y la posterior diferenciación hacia macrófagos en recubiertos con teflón FEP bolsas de cultivo celular resulta en un elevado número de macrófagos y sin la necesidad de procedimientos técnicamente difíciles o caros. Los macrófagos obtenidos pueden ser utilizados para el análisis posterior que van desde clásica a través de la activación de LPS a la co-cultivo con células tumorales.

Las células de la estirpe monocítica y sus derivados terminales diferenciadas - macrófagos - muestran una plasticidad notable en lo que respecta a su función biológica, con miras a su participación en procesos tan diversos como el desarrollo, la reparación de tejidos, y la inmunidad 1. Esto último se debe a su capacidad fagocítica y presentadora de antígeno que sitúa los macrófagos en la encrucijada entre la respuesta inmune innata y adaptativa 2. Sin embargo, su capacidad para secretar citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y otras moléculas de señalización 1 no sólo aumenta su función inmuno-moduladora sino que también sirve como base para sus funciones adicionales. Los intentos de reflejar estas diversas etapas de activación en el contexto de la no-microbianas condiciones mediadas han dado lugar a las categorías M1 y M2 3. Aunque esta clasificación no es completa, permite un conocimiento básico de la biología de los macrófagos. Debido a estas capacidades multifacéticas que no es ninguna sorpresa que los macrófagos están asociados con muchas condiciones que de alguna manera implican la remodelación tisular o inflamación. Junto a su papel fundamental en el reconocimiento y liquidación de los patógenos invasores 4-6, macrófagos han llegado cada vez más en el foco en la aterosclerosis, fibrosis, la obesidad y el cáncer de 7-10. Un método reproducible para la generación de macrófagos humanos es por lo tanto crucial para la comprensión de estas patologías. Aquí presentamos un método basado en el aislamiento de monocitos humanos de la sangre periférica de donantes sanos mediante una técnica de doble centrifugación en gradiente de densidad como se ha descrito anteriormente 11. Con el fin de facilitar la diferenciación hacia los macrófagos, las células monocíticas aislados se incuban en presencia de bajas concentraciones de M-CSF y suero humano normal 12. Para facilitar aún más el manejo y la cosecha celular, la diferenciación se lleva a cabo en el gas permeable FEPBolsas de cultivo celular recubiertos de teflón con una superficie hidrófoba 12-15. Los macrófagos en reposo resultantes pueden ser sometidos a una amplia gama de ensayos, ya que todavía son capaces de responder, ya sea en un modo M1 o M2-similares. Los métodos alternativos de aislamiento de monocitos y la posterior diferenciación tales como la clasificación de células activadas magnético (MACS) o elutriación centrífuga (CCE) tienen algunas limitaciones en cuanto al rendimiento, el coste y tiempo requerido. El protocolo descrito en el presente documento ofrece la ventaja de que puede llevarse a cabo con equipo de laboratorio estándar sin la necesidad de reactivos especiales (por ejemplo, perlas magnéticas MACS) o dispositivos (por ejemplo, aparatos CCE) y permite el procesamiento de grandes cantidades de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Los macrófagos humanos están implicados en una plétora de procesos patológicos que van desde enfermedades infecciosas al cáncer. Así que representan una herramienta valiosa para comprender los mecanismos subyacentes de estas enfermedades. Por lo tanto, se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento de monocitos humanos a partir de capas leucocitarias, seguido de un procedimiento de diferenciación que resulta en altos rendimientos de los macrófagos. La técnica se basa principalmente en equipos de laboratorio comúnmente disponibles y por lo tanto proporciona una manera costo y tiempo efectivo para obtener grandes cantidades de macrófagos humanos. Brevemente, capas leucocitarias de donantes de sangre sanos se someten a una centrifugación en gradiente de densidad doble para cosechar los monocitos de la sangre periférica. Estos monocitos se cultivan a continuación en etileno propileno (FEP) recubiertos de teflón bolsas fluorados de cultivo de células en presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Los macrófagos diferenciados pueden ser cosechados y utilizados para estudios posteriores y funcional con la misma facilidaddice. Métodos importantes para el control de calidad y validación de las medidas de aislamiento y diferenciación se resaltarán en el protocolo. En resumen, el protocolo descrito aquí permite a los científicos para aislar de forma rutinaria y reproducible macrófagos humanos sin la necesidad de herramientas de coste intensivo. Por otra parte, los modelos de enfermedades se pueden estudiar en un sistema humano singénica eludir el uso de macrófagos murinos.

La primera centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll produce una interfase blanca que contiene las PBMC (Figura 1A) es decir, linfocitos y monocitos. Esto puede ser confirmado a través de una tinción de May-Gruenwald (Figuras 1B y C) de las células recogidas que muestra tanto una alta relación núcleo / citoplasma (típico de los linfocitos) y Bean o núcleos en forma de anillo (típico de los monocitos). Cuando estas células se cargaron en un gradiente de densidad utilizando Percoll segundos, los monocitos se pueden separar más lejos de los linfocitos y de nuevo aparecerá como una interfase blanca (Figuras 1D-F). Para cada capa leucocitaria de la centrifugación en gradiente de densidad doble descrito produce rutinariamente 150 ± 40 x 10 6 monocitos que pueden diferenciarse a 70 ± 30 x 10 6 macrófagos (Figura 2) por capa leucocitaria. El rendimiento medio de los macrófagos20 preparaciones independientes fue 47 ± 14% del total de monocitos aislados. Después de la centrifugación en gradiente de Percoll que aún puede haber algunas células no monocíticas residuales presentes en la preparación, que es dependiente de la donación de sangre, así como en la precisión del proceso de aislamiento. Sin embargo, después de la fase de diferenciación de 6-7 días, la preparación consiste principalmente en macrófagos maduros (Figura 3), que se puede enriquecer aún más debido a su adherencia a las superficies de plástico, una característica que no es compartida por las células contaminantes al azar (Figuras 4A y B). Una vez chapado, la mayoría de los macrófagos muestran una morfología clásica &quot;huevo frito&quot;, mientras que también hay células con un fenotipo extendido huso-como (Figuras 4C y D). Esto se refleja en su distribución F-actina dentro de los grupos de citoplasma y de adhesión. Las células diferenciadasse caracterizan por la expresión de CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor de manosa), CD11b y CD11c que son marcadores típicos de macrófagos maduros (Figura 5). La presencia de CD11b argumenta en contra de una diferenciación predominantemente dendríticas que es apoyado por el hecho de que las células son negativas para el marcador de células dendríticas CD209 (DC-SIGN). Después del proceso de diferenciación de las células permanecen funcionalmente y metabólicamente activo durante aproximadamente 5-7 días (Figura 6), ya que puede ser visualizado por tinción con calceína AM y su capacidad para tomar hasta vesículas extracelulares se desprenden de las células tumorales. Además, las células todavía pueden ser activadas como se muestra por ejemplo, para la estimulación con lipopolisacárido (LPS), que resulta en la expresión de varios genes pro-inflamatorios (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Apariencia y composición de la PBMC- y monocitos-capa después de gradiente de densidad doble centrifugación. Fotografía que ilustra (A) la banda de PBMC después de la gradiente de Ficoll y (D) la fase de monocitos después de la centrifugación Percoll iso-osmótica. Tinciones May-Gruenwald de cytospin preparativos de la (B, C) ​​fracción PBMC y el restante (E, F) monocitos. Barra de escala = 200 micras en B y E, = 50 micras en C y F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Rendimiento de los monocitos y los macrófagos. Conteos celulares representativos de monocitos y macrófagos aislados de 20 leucocitaria capa preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. micrografías y mediciones de tamaño de celda de monocitos y macrófagos. Microscopía de contraste de fase de suspensión celular monocítica antes (A) y después (B) diferenciación de los macrófagos. Correspondiente histogramas de tamaño de celda de monocitos (C) y macrófagos (D). Barra de escala = 100 m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Morfología y la organización del citoesqueleto de los macrófagos adherentes. Microscopía de contraste de fase de los macrófagos adherentes antes (A) y después (B) la eliminación de la falta de adherenT células. Tinción (C, D) faloidina-TRITC de actina filamentosa en macrófagos adherentes, no estimuladas. Barra de escala = 100 micras en AC, 20 micras de D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. inmunofenotipo de macrófagos diferenciados. Citometría de flujo de los macrófagos después de 6 días de diferenciación en bolsas de cultivo celular recubiertas con Teflon FEP (indicado en rojo). Los controles de isotipo correspondientes se muestran en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 6. Captación de microvesículas celulares tumorales por macrófagos. Micrografías de macrófagos adherentes después de la exposición a la etiqueta-PKH26 microvesículas derivadas de células tumorales (rojo fluorescente). Las imágenes se superpusieron a la correspondiente (A) campo claro o (B) tinción citosólica con la viabilidad de colorante calceína AM. Las barras de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Upregulation de IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, y MT1-MMP después de Stimumento de macrófagos con LPS (100 ng / ml) durante 24 h. La expresión génica se midió mediante RT-PCR cuantitativa a partir de muestras de ARN total (A) y normalizado en HPRT1 y GNB2L1 expresión. Los valores que se muestran son los cambios veces en comparación con el control sin tratar (media ± desviación estándar, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa e IL-6 en la inducción de la estimulación LPS se confirmó por ELISA (B) (media ± SD, * p &lt;0,05).

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

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