Name: isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Författarna vill tacka Mrs Meike Schaffrinski för hennes alltid utmärkt tekniskt stöd under de senaste åren. Detta arbete har finansierats genom den tyska forskningsrådet (DFG) inom den gemensamma forskargruppen 942 (FOR942) och genom forskningsprogrammet Medicinska fakulteten, Georg-August-universitetet Göttingen.

1. Beredning av Steril humant AB-serum <ol><li> Samla 4-5 påsar med färskfrusen plasma (FFP). Store påsar vid -20 ° C tills tillräckligt många påsar har samlats in. </li><li> Tina påsar och inkubera under 30 min vid 56 ° C i ett vattenbad för att inaktivera komplement och avlägsna fibrin. </li><li> Grundligt desinficera utsidan av påsarna och överför plasma till 50 ml rör. </li><li> Centrifugera vid 3000 xg under 15 minuter vid rumstemperatur för att bli av fällningar och rest trombocyter. </li><li> Pool alla supernatanter och kasta pelletsen. </li><li> Alikvot serumprover i 15 ml rör och förvara vid -20 ° C. OBS: Alternativt kan användas kommersiellt tillgängliga värmeinaktiverat normalt humant AB-serum. </li></ol> 2. Isolering av monocyter För att underlätta balansering av centrifugen, rekommenderas att behandla två gula hinnor parallellt. Men ta care att använda separata material för varje givare och inte blanda cellerna. Om inte kan erhållas gula hinnor enkelt kan 400 ml hepariniserat perifert blod användas i stället. <ol><li> Försiktigt desinficera plastpåsar innehållande buffy coats och överför innehållet i varje lättcellskoncentratet till två 50 ml rör. </li><li> För varje buffycoat fylla tre 50 ml-rör med 15 ml FicoU-lösning (1,077 g / ml). Den Ficoll bör vara vid rumstemperatur under beredningen. </li><li> Skikt 30-35 ml buffy coat blod ovanpå Ficoll lösning för första densitetsgradient. Var noga med att göra det långsamt och försiktigt för att undvika att blanda båda lagren. </li><li> Centrifugera vid 400 x g utan broms för 30 min vid rumstemperatur. </li><li> För varje gradient samla vit ring av perifera mononukleära blodceller (PBMC), som är belägna mellan de två faser med en plast pasteurpipett och överför till ett 50 ml rör. </li><li> Fyll varje rör med PBS-EDTA (1 mM) upp till 40 ml totalt. </li><li> Centrifugera vid 300 xg under 10 minuter utan broms i rumstemperatur. </li><li> Aspirera supernatanten och tvätta pelleten återigen med 40 ml PBS-EDTA (1 mM). </li><li> För varje donatorpool pelletsen i 20 ml RPMI-1640 utan fenolrött + 10% FCS. </li><li> Förbered iso-osmotisk Percoll-lösning för den andra densitetsgradient: För två donatorer blanda 23,13 ml Percoll-lösning (densitet: 1,131 g / ml) i ett 50 ml rör med 1,87 ml 10-faldig PBS. Därefter överförs 23 ml av denna lösning i ett annat 50 ml rör och tillsätt 27 ml RPMI-1640 med fenolrött + 10% FCS för att erhålla en 46% ISO-osmotisk Percoll-lösning. The Percoll bör vara vid rumstemperatur under beredningen. </li><li> För varje givare överföring 25 ml av den beredda Percoll-lösning till en 50 ml tub och lager PBMC lösningen framställd i 2,9) på toppen av Percoll-lösning. Var noga med att göra det mycket långsamt ettd noga, båda skikten tenderar att blanda lätt. Om det görs på rätt sätt de två faserna kan skiljas på grund av deras skillnad i färg. </li><li> Centrifugera vid 550 xg utan broms i 30 minuter vid rumstemperatur. </li><li> För varje lutning samlar den vita ringen av monocyter som ligger mellan de två faser med en plast Pasteur pipett och överför till en 50 ml tub. </li><li> Fyll varje rör med PBS-EDTA (1 mM) upp till 50 ml totalt. </li><li> Centrifugera vid 400 xg under 10 min utan broms vid rumstemperatur. </li><li> Aspirera supernatanten och resuspendera pelletsen i 20 ml RPMI-1640 med fenolrött + 10% FCS. </li></ol> 3 Differentiering av monocyter till makrofager <ol><li> Bestäm antal isolerade monocyter i en 1:10 utspädning i trypanblått. Endast räknar de stora, ofta oregelbundet formade celler, som är monocyter. Räkna inte de mindre, runda formade celler som lymfocyter. NOTE: Monocyte siffror behöver inte bestämmas alltför noggrant eftersom de bara ger en fingervisning om hur många och vilka FEP teflonbelagd påsar (små eller stora) måste användas för differentiering av cellerna. </li><li> För 1,0-1,5 x 10 8 monocyter från en donator, utsäde cellerna i en stor FEP teflonbelagd cellodling väska. För varje påse förbereda odlingsmedium bestående av 174 ml RPMI-1640, 2% humant AB-serum (såsom framställd i avsnitt 1), 1% penicillin / streptomycin och 2,5 ng / ml M-CSF (total volym: 180 ml). <ol><li> För 3,0-5,0 x 10 7 monocyter från en donator, ympa cellerna i en liten teflonbelagd cellodlings påse. För varje påse förbereda odlingsmedium bestående av 28,5 ml RPMI-1640, 2% humant AB-serum (såsom framställd i avsnitt 1), 1% penicillin / streptomycin och 2,5 ng / ml M-CSF (total volym: 30 ml). OBS: Om t ex är 8,0 x 10 7 monocyter erhållna rekommenderar vi att utsäde dem i two mindre volym påsar med 4,0 x 10 7 celler vardera. I stället för M-CSF, kan monocyter alternativt differentieras med granulocyt makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF) vid samma koncentration (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Lägg cellsuspensionen (20 ml) till den förbehandlade mediet och blanda noggrant. Om två påsar framställes från en givare, tillsätt 20 ml RPMI-1640 till cellsuspensionen och sedan lägga till hälften av suspensionen till varje medium beredning. </li><li> Valfritt: För att bestämma om monocyten beredningen har varit steril, riva en droppe av cellsuspensionen på en blodagarplatta och inkubera över natten vid 37 ° C. </li><li> Dra åt hölje av en 50 ml Infusionssprutan på kontakten på FEP teflonbelagd cellodling påse och fyll den med det färdiga cellsuspension. </li><li> Dra ut sprutan och tryck den återstående luften ur påsen. Stäng påsen med en avslutande kon. </li><li> Inkubera påsar för 6-7 dagar vid 3776, C med 5% CO2. </li></ol> 4. Macrophage Harvest <ol><li> Placera FEP Teflon-belagda cellodlingspåsar med de differentierade makrofager på is i minst 1 timme för att underlätta att cellerna lossnar (en inkubationstid på upp till 3 timmar är möjligt). Se till att hela ytan av påsen är täckt med is. </li><li> Dra påse med minimalt tryck 10x över kanten på ett bord / styrelse. </li><li> Försiktigt desinficera utsidan av påsen och ta bort stängnings konen. </li><li> Dra en 50 ml spruta på kontakten av påsen, ta bort cellsuspension, och överföra den till 50 ml rör. </li><li> Centrifugera vid 400 xg under 10 minuter vid rumstemperatur för att spinna ned cellerna. </li><li> Aspirera supernatanten och samla pellets från en påse i 10 ml RPMI-1640 + 10% FCS totalt. </li><li> Bestäm antalet celler i en hemocytometer (1: 4 till 1: 10 utspädning i trypanblått). Bara räkna stora runda cellerna. OBSERVERA: Efter differentiering makrofagerna i FEP-teflonbelagda påsar kan det finnas restceller t.ex. lymfocyter, beroende på donatorn och om kvaliteten på den monocyt isolering. </li><li> För att återanvända FEP Teflon-belagda väskor, tvätta dem två gånger med 70% etanol för att avlägsna kvarvarande celler. Fyll dem med 50 ml 70% etanol och inkubera över natten. Tvätta påsar 3x med steril PBS, slå in dem i steriliseringspapper och sterilisera i en autoklav med hjälp av standardförfaranden. OBS: De cellodlingspåsar kan återanvändas flera gånger utan någon förlust i makrofager avkastning. Men vi beslutade att kasta påsarna efter 10 använder innan de börjar läcka. </li><li> För efterföljande experiment kultur makrofager i RPMI-1640 + 10% FCS. Om lägre serumkoncentration krävs, är också möjlig odling i RPMI-1640 med 1% FCS. Seed och inkubera cellerna under 3-4 tim. Efter denna period, notera att makrofager fäster på ytan av cellodlingsskål samtidigteventuella kontaminerande celler (dvs erytrocyter, lymfocyter, och dendritiska celler) stanna i suspension. Tvätta celler åtminstone två gånger med PBS för att avlägsna icke vidhäftande celler. </li><li> För att ta bort odlade makrofager från cellodlingsskål för ytterligare experiment, försiktigt skrapa bort dem från ytan. Alternativt inkubera rätter för 20 minuter på is, aspirera odlingsmedium, och tillsätt 1 ml enzymfritt cell dissociationsbuffert. Efter 5 min inkubation vid 37 ° C, tillsätt 4 ml PBS, och ta bort celler genom att pipettera upp och ned i minst 3 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna eftersom ingen intressekonflikt föreligger.

Makrofager är viktiga effektorceller i det medfödda immunförsvaret och visar viktiga funktioner i immunmodulering, antigenpresentation och vävnad homeostas. På grund av deras märkliga plasticitet, de kan reagera på olika stimuli med förändringar i deras fenotyp. Men än så länge en hel del uppgifter om makrofag polarisering erhållits i murina systemet, även om det finns rapporter som visar att endast omkring 50% av makrofag polarisering markörer kan direkt översättas från mus till människa 16. Därför presenterar vi här ett förfarande för erhållande av primära humana makrofager i tillräckligt antal och renhet utan behov av dyra material, t.ex. MACS magnetiska kulor eller en motströms centrifugal elutriation anordningen. Vår metod bygger på isolering av monocyter från PBMC och deras senare differentiering till makrofager i FEP teflonbelagd cellodlingspåsar i närvaro av låga concentrations av M-CSF från 11 till 13. Medan monocyter utgör mindre än 5 till 10% av perifert blod leukocyter hos människor, vid stimulering de rekryteras till perifera platser där de differentierar till inhemska vävnadsmakrofager eller dendritiska celler 17. Den cytokin M-CSF är viktigt för monocyt överlevnad och driver deras differentiering till makrofager 18,19. Hittills M-CSF koncentrationer som valts ut för monocyt differentiering varierade upp till 100 ng / ml, men i våra protokoll har vi möjlighet att få tillräckligt antal mogna makrofager med en M-CSF koncentration på endast 2,5 ng / ml 12 , 20. Dessutom celler odlas i FEP Teflon-belagda cellodlingspåsar som underlättar avskiljandet av makrofager och deras senare sådd i definierade cellantal. Eftersom påsarna kan återanvändas flera gånger, denna ytterligare minskar kostnaderna för isoleringsprocessen. De makrofager erhållna genom detta förfarandeär mycket positiva för CD45, CD14, CD11b, CD11c och visar uttryck av mannosreceptorn CD206, som argumenterar för en population av rena, mogna makrofager 21,22. Särskilt höga CD14 uttryck är typiskt för makrofager differentierade i närvaro av M-CSF 23. Efter sådd av cellerna, uppvisar de en snabb vidhäftning till plastytor med vissa celler visar en typisk spindel-liknande morfologi, medan andra uppvisar ett stekt ägg fenotyp. Detta är i enlighet med de iakttagelser från andra författare 18,22,24. Det rapporterades att monocyter differentiering i närvaro av M-CSF leder till M2-makrofager polarise 16,25. Men makrofagerna isolerade genom våra protokoll kan fortfarande svara på en rad olika stimuli, inklusive exponering för tumör-cellerna mikrovesiklar samt co-kultur med tumörceller 26,27 eller exponering för LPS som de reagerar med induktion av pro- inflammatoriska gener såsom IL-1 &amp;# 946 ;, TNF, Wnt5a eller olika matrixmetalloproteinaser som anses typiska för M1-makrofager polarise 3,5,28. Sammanfattningsvis isolering av monocyter genom dubbel densitetsgradientcentrifugering och efterföljande differentiering mot makrofager i FEP Teflon-belagda cellodlingspåsar resulterar i höga antal av makrofager utan behov av tekniskt svåra eller kostsamma förfaranden. De erhållna makrofager kan användas för efterföljande analys som sträcker sig från klassiskt aktivering genom LPS i samodling med tumörceller.

Celler från monocytiska härstamning och deras terminalt differentierade derivat - makrofager - uppvisar en slående plasticitet i avseende på deras biologiska funktion, vilket leder till deras medverkan i så skilda processer som utveckling, vävnad reparera och immunitet 1. Det senare beror på deras fagocytiska och antigenpresenterande förmåga som placerar makrofager i korsningen mellan det medfödda och adaptiva immunsvaret 2. Men deras förmåga utsöndra cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer och andra signalmolekyler 1 inte bara förstärker deras immunmodulerande funktion, utan också ligger till grund för att de ytterligare funktioner. Försök att spegla dessa olika aktiveringssteg i samband med icke-mikrobiella medierade tillstånd har lett till M1 och M2 kategori 3. Även om denna klassificering är inte komplett, möjliggör det en grundläggande förståelse av makrofager biologi. På grund av dessa mångfacetterade kapacitet det kommer inte som någon överraskning att makrofager är förknippade med många villkor som på något sätt involverar vävnadsombildning eller inflammation. Bredvid deras grundläggande roll i erkännandet och röjning av invaderande patogener 4-6, har makrofager alltmer kommit i fokus i ateroskleros, fibros, fetma och cancer 7-10. En reproducerbar metod för generering av mänskliga makrofager är därför avgörande för förståelsen av dessa sjukdomar. Här presenterar vi en metod baserad på isoleringen av humana monocyter från perifert blod från friska donatorer genom en dubbel densitetsgradientcentrifugering teknik som beskrivits tidigare 11. För att underlätta differentiering mot makrofager, är de isolerade monocytiska celler inkuberades i närvaro av låga koncentrationer av M-CSF och normalt humant serum 12. För att underlätta vidare hantering och cellskörd, är differentiering utförs i gaspermeabelt FEPTeflon-belagd cellodlingspåsar med en hydrofob yta 12-15. De resulterande vilande makrofager kan utsättas för ett brett spektrum av analyser såsom de fortfarande är i stånd att svara på antingen en M1 eller M2-liknande sätt. Alternativa metoder för monocyt isolering och efterföljande differentiering såsom magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) eller motströms centrifugal slamning (CCE) har vissa begränsningar när det gäller avkastning, kostnad och tid som krävs. Protokollet som beskrivs häri erbjuder fördelen att den kan utföras med standardlaboratorieutrustning utan behov av särskilda reagenser (t.ex. MACS magnetiska kulor) eller anordningar (t.ex. CCE apparater) och möjliggör behandling av stora mängder celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Mänskliga makrofager är involverade i en uppsjö av patologiska processer, från infektionssjukdomar till cancer. Alltså de utgör ett värdefullt verktyg för att förstå mekanismerna bakom dessa sjukdomar. Vi presenterar därför ett enkelt protokoll för isolering av humana monocyter från buffy coats, följt av en differentieringsförfarande som resulterar i höga makrofag avkastning. Tekniken bygger till största delen på allmänt tillgängliga labbutrustning och därmed ger ett kostnadseffektivt och tidsbesparande sätt att få stora mängder humana makrofager. I korthet buffy coats från friska blodgivare utsätts för en dubbel densitetsgradientcentrifugering för att skörda monocyter från perifert blod. Dessa monocyter odlas därefter i fluorerade eten-propen (FEP) Teflon-belagda cellodlingspåsar i närvaro av makrofag-kolonistimulerande faktor (M-CSF). De differentierade makrofager lätt kan skördas och användas för efterföljande studier och funktionell somsäger. Viktiga metoder för kvalitetskontroll och validering av isolering och differentieringssteg kommer att belysas i protokollet. Sammanfattningsvis det protokoll som beskrivs här möjliggör för forskare att rutinmässigt och reproducerbart isolera mänskliga makrofager utan behov av kostnadskrävande verktyg. Vidare kan sjukdomsmodeller studeras i en syngen mänskliga systemet kringgår användningen av murina makrofager.

Den första densitetsgradientcentrifugering med användning av Ficoll ger en vit mellanfas innehållande PBMC (fig 1A) dvs lymfocyter och monocyter. Detta kan bekräftas genom ett May-Grünwald färgning (figur 1B och C) av de insamlade celler som visar både en hög kärna / cytoplasma ratio (typiska för lymfocyter) och bean- eller ringformade kärnor (typiskt för monocyter). När dessa celler sedan på en andra densitetsgradient använder Percoll kan monocyter ytterligare separeras från lymfocyterna och återigen visas som en vit mellanfas (figur 1D-F). För varje lättcellskoncentratet den beskrivna dubbla densitetsgradientcentrifugering ger rutinmässigt 150 ± 40 x 10 6 monocyter som kan differentieras till 70 ± 30 x 10 6 makrofager (Figur 2) per buffy coat. Medelvärdet makrofag avkastningen från20 oberoende preparat var 47 ± 14% av den totala isolerade monocyter. Efter Percoll gradientcentrifugering fortfarande kan finnas vissa kvarvarande icke-monocytiska celler i preparatet som är beroende av blodgivare samt riktigheten i isoleringsprocessen. Men efter differentieringsfasen av 6-7 dagar, består preparatet i huvudsak av mogna makrofager (fig 3) som kan ytterligare anrikade på grund av deras vidhäftning till plastytor, en egenskap som inte delas av de slumpvisa kontaminerande celler (figurerna 4A och B). När pläterade, majoriteten av makrofagerna visar en klassisk &quot;stekt ägg&quot; morfologi medan det finns också celler med en utsträckt spindel-liknande fenotyp (Figurerna 4C och D). Detta speglas av deras F-aktin distribution inom cytoplasman och vidhäftnings kluster. De differentierade cellerkännetecknas av uttrycket av CD45, CD14, CD16, CD206 (mannos receptor), CD11b och CD11c som är typiska markörer för mogna makrofager (Figur 5). Förekomsten av CD11b talar emot en övervägande dendritiska differentiering som stöds av det faktum att cellerna är negativa för den dendritiska cellen markör CD209 (DC-SIGN). Efter differentieringsprocessen cellerna förblir funktionellt och metaboliskt aktiva i ca 5-7 dagar (Figur 6), eftersom det kan visualiseras genom Calcein AM färgning och deras förmåga att ta upp extracellulära vesikler skjul från tumörceller. Dessutom kan cellerna fortfarande aktiveras, såsom visas t ex för stimulering med lipopolysackarid (LPS) som resulterar i expressionen av flera proinflammatoriska gener (Figur 7). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ filer / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figur 1 Utseende och sammansättning PBMC- och monocyt-lager efter dubbla densitetsgradientcentrifugering. Fotografi som illustrerar (A) PBMC-bandet efter Ficoll gradienten och (D) monocyten-fasen efter iso-osmotiska Percoll centrifugering. May-Gruenwald färgningar av cytospinberedningar av (B, C) ​​PBMC fraktion och resterande (E, F) monocyter. Scale bar = 200 | am i B och E, = 50 | im i C och F. <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figur 2 Utbyte av monocyter och makrofager. Representativa cell countings av isolerade monocyter och makrofager av 20 buffy coat preparations. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figur 3. Micrographs och cellstorleksmätningar av monocyter och makrofager. Faskontrastmikroskopi av monocytisk cellsuspension före (A) och efter (B) makrofagdifferentiering. Motsvarande cellstorlek histogram av monocyter (C) och makrofager (D). Scale bar = 100 | im. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figur 4 Morfologi och cytoskelettala organisation vidhäftande makrofager. Faskontrastmikroskopi från tillhörande makrofager före (A) och efter (B) avlägsnande av adherenT-celler. (C, D) Phalloidin-TRITC färgning av filamentöst aktin i vidhäftande, icke-stimulerade makrofager. Skala bar = 100 nm i AC, 20 nm i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5 immunofenotyp differentierade makrofager. Flödescytometrianalys av makrofager efter 6 dagar av differentiering i FEP Teflon-belagda cellodlingspåsar (markerade med rött). Motsvarande isotypkontroller visas i grått. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Figur 6 Upptag av tumörcells mikrovesiklar av makrofager. Micrographs av vidhäftande makrofager efter exponering för PKH26-märkta (röd fluorescerande) tumör-cellerna mikrovesiklar. Bilderna överlagras till motsvarande (A) bright eller (B) cytosolic färgning med livskraft färgämnet kalcein AM. Skala barer = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7 uppreglering av IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, och MT1-MMP efter stimulation av makrofager med LPS (100 ng / ml) under 24 tim. Genuttryck mättes med kvantitativ RT-PCR från de totala RNA-prov (A) och normaliserade på HPRT1 och GNB2L1 uttryck. De visade värdena är faldiga förändringar i jämförelse med den obehandlade kontrollen (medelvärde ± SD, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa och IL-6 induktion enligt LPS-stimulering bekräftades ytterligare genom ELISA (B) (medel ± SD, * p &lt;0,05).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Vi presenterar ett enkelt och effektivt protokoll för generering av humana makrofager. Buffy coats bearbetas av dubbel densitetsgradientcentrifugering och isolerade monocyter därefter differentieras till makrofager i teflonbelagda cellodlingspåsar. Detta maximerar makrofag avkastning och underlättar cellskörd för efterföljande experiment.

Isolering av humana monocyter från Double gradientcentrifugering och deras differentiering till makrofager i teflonbelagda Cell Culture Väskor

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live avbildning antimykotiskt av humana primära neutrofiler och monocyter som svar på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Inducerad differentiering av M-Cellliknande celler i humana stamcells-härledda ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...