Name: automated analysis of dynamic ca2+ signals in image sequences
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535, e MOP-93676.

1. Dissezione della nave e Imaging <ol><li> Tessuto raccolto da suini giovanili nazionali, come descritto nella Martens et al 27. Posizionare raccolte ventricoli destro suina in un polidimetilsilossano (PDMS) piatto dissezione fondo contenente HEPES tamponata soluzione fisiologica (PSS). <ol><li> Con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio, sezionare e rimuovere un segmento discendente anteriore dell&#39;arteria coronaria (~ lunghezza 8 mm, diametro 0,5 mm) dal tessuto circostante con pinze e forbic...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li><li>Berridge, M. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li><li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2++signals+in+image+sequences.">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2++signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries.">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li><li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Ca2++signal+modalities+in+the+vascular+endothelium.">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li><li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways:+studies+with+normal+pig,+cystic+fibrosis+human,+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi.">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li></ol>

Decodifica complessi Ca 2 + segnali a livello cellulare e multicellulare richiederà approcci sperimentali e analitici rigorosi. Qui, un approccio è descritto in cui il tempo risolti sequenze di immagini confocale di Ca 2 + fluorescenza dipendenti sono sottoposti ad una analisi automatizzata che identifica e quantifica statisticamente rilevanti Ca 2 + segnali all&#39;interno di campi di cellulari intatti nel caso specifico presentato, un segmento di arteria è stata isolata dal cuore di...

Ca 2 + è un secondo messaggero onnipresente molecola di segnalazione e Ca 2 + citosolico livelli sono altamente regolamentati. Intracellulare di Ca 2 + segnali sono complesse e includono transitori isolate, oscillazioni e moltiplicazione onde 1-4. Controllo spaziale e temporale di Ca 2 + è pensato per essere alla base fisiologica specificità del segnale, e quindi l&#39;analisi di Ca 2 + modelli di segnale è di notevole interesse per gli investigatori in più campi 5. Coloranti Ca 2 + indicatore come Fluo-4 e Fura-2 sono comunemente impiegati per misurare Ca2 + intracellulare segnali con fluorescenza microscopia 5-12. Tipicamente, temporali Ca 2 + segnali vengono valutati come cambia il tempo-dipendenti medio di fluorescenza all&#39;interno di un&#39;area definita dall&#39;utente, o regione di interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Attualmente, analisi del ROI manuale sia in termini di tempo e di lavoro intensiva perché richiede agli utenti di identificare molti ROI ed eseguire calcoli ripetitivi 17 - 19. Queste tecniche possono essere soggette a notevoli errori degli utenti, compresa l&#39;introduzione di modalità di segnali artificiali e l&#39;esclusione di segnali diffusi 18,20 bassa ampiezza o. Algoritmi di rilevamento ROI automatizzati sono stati precedentemente implementato utilizzando una varietà di approcci statistici per determinare il posizionamento ottimale ROI, ma sono stati generalmente limitata all&#39;analisi della scansione linea o pseudo-line immagini di scansione, che limita l&#39;analisi ad una sola dimensione spaziale nel tempo 17, 19-22. Inoltre, molti algoritmi esistenti non sono sufficienti per comprendere la diversità di Ca 2 + eventi di rilascio che vanno da periodici, transitori localizzati di onde che si propagano 23,24. Valutazione complessiva delle fisiologiche Ca 2 + segnali è spesso ulteriormente complicata dalla presenza di una significativa artif immagineatto che confonde il segnale alla discriminazione rumore in molti sistemi sperimentali. In precedenza, una soluzione algoritmo di rilevamento ROI automatizzato per Ca 2 + segnale di rilevamento transitorio, implementato come plugin per il software NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), è stato sviluppato e convalidato 25,26. Questo algoritmo, chiamato LC_Pro, è stato progettato per identificare e analizzare ROI comprende Ca 2 + transitori di segnale bidimensionali time lapse sequenze di immagini. Qui un protocollo sperimentale e dimostrazione pratica rappresentativo di una applicazione dell&#39;algoritmo in porcino coronarico endotelio è fornito, con postprocessing aggiuntiva utilizzando l&#39;open source software di elaborazione statistica R per generare output grafico utilizzabile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissection dish</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:119px;">#08-772-70</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:119px;">#NC9644388</td>
			<td>elastomer kit, must be molded into dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES-buffered PSS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#H3375-250G</td>
			<td>HEPES acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon Inst.</td>
			<td style="width:119px;">#MNA42000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">#11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">spring scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">tungsten wire</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Inst Svcs</td>
			<td style="width:119px;">#406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:71px;">Life Tech.</td>
			<td style="width:119px;">#F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pluronic F-127</td>
			<td style="width:71px;">Life Tech.</td>
			<td style="width:119px;">#P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">metal pins</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">#26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cover-glass bottom chamber</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom designed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">spinning disc confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">RS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">imageJ software</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC_Pro plugin for imageJ</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">R software</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">download at: http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">R traceplot script</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of dynamic ca2+ signals in image sequences

Intracellulare di Ca 2 + segnali sono comunemente studiate con coloranti fluorescenti Ca 2 + indicatore e le tecniche di microscopia. Tuttavia, l&#39;analisi quantitativa di Ca 2 + dati di imaging è in termini di tempo e soggetto a bias. Automatizzati algoritmi di analisi del segnale in base alla regione di interesse (ROI) rilevazione sono state implementate per scansione misurazioni linea unidimensionale, ma non esiste alcun algoritmo corrente che integra identificazione ottimizzata e analisi di ROI in sequenze di immagini bidimensionali. Qui un algoritmo per acquisizione rapida e analisi di ROI in sequenze di immagini è descritto. Utilizza ellissi adattano ai segnali filtrati rumore per determinare il posizionamento ottimale ROI, e calcola i parametri del segnale Ca 2 + di ampiezza, durata e distribuzione spaziale. Questo algoritmo è stato implementato come plugin liberamente disponibile per ImageJ (NIH) software. Insieme con gli script di analisi scritti per l&#39;open source software di elaborazione statistica R,questo approccio fornisce una pipeline ad alta capacità per l&#39;esecuzione di analisi statistiche rapida della produzione sperimentale. Gli autori suggeriscono che l&#39;uso di questo protocollo di analisi porterà ad una caratterizzazione più completa e imparziale di fisiologica Ca 2 + segnalazione.

Un algoritmo personalizzato, LC_Pro, è stato sviluppato e realizzato al fine di effettuare l&#39;analisi automatizzata di Ca 2 + dinamiche su sequenze di immagini confocale. Come illustrato nella figura 1, l&#39;algoritmo utilizza moduli di elaborazione sequenziale a) individuare e siti di traiettoria dinamica Ca 2 + cambiare sopra statistico (p &lt;0.01) rumore, B) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e C) il calcolo dell&#39;intensità me...

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Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca 2 + con l&#39;input minimo da parte dell&#39;utente e pregiudizi.

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Biology

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