Name: measurement of heme synthesis levels in mammalian cells
Uploaded: 2015-07-09T13:00:00
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Die HCC4017 und HBEC30KT Zelllinien wurden freundlicherweise von Dr. John Minna Labor zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Cecil und Ida H. Grün Mittel Dr. Li Zhang unterstützt.

ACHTUNG: Während der Arbeit mit Radioaktivität, geeignete Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination des Experimentators und die Umgebung zu vermeiden. Entsorgen Sie alle Abfälle folgenden lokalen Strahlenschutz-Richtlinien. 1. Herstellung der Zellen <ol><li> Saatgutzellen in 3,5 cm-Platten, so dass die Konfluenz erreicht 80% -90% am Tag des Tests. <ol><li> Man beachte, dass der Aussaat Konfluenz für Zellen hängt vom Zelltyp und ihre Wachstumsrate. Bei der Behandlung von Zellen mit e...

Häm spielt eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Zellenergie über die Atmung 26. Verändert Hämstoffwechsel bekanntermaßen mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs 28,41 zugeordnet sein. Die Inhibition der Häm-Synthese ist bekannt, Zellzyklusarrest und Apoptose in HeLa-Zellen 26,41 führen. Es hat sich gezeigt, dass hohe Hämsynthese Pegel wird mit dem Fortschreiten der Lungenkrebszellen 28 verbunden. Daher wäre es von großer Bedeutung sein, um die Nivea...

Häm, ein Komplex von Eisen und Protoporphyrin IX ist ein Zentralmolekül für den Transport und die Verwendung von Sauerstoff in praktisch allen lebenden Organismen 1-3. Die einzigartige Struktur der Häm ermöglicht es, als Träger von zweiatomigen Gase und Elektronen funktioniert, sowie auf verschiedene andere Funktionen 1-5 auszuführen. Bindet beispielsweise Häm zu Sauerstoff im Hämoglobin und Myoglobin für die Übertragung und Speicherung von Sauerstoff 6,7. Es funktioniert auch als Elektronenüberträger in der Cytochrome während der Atmung und wirkt als Elektronendonor für Redox-Reaktionen, die durch Cytochrom P450 Enzyme 8,9 katalysiert. Eines der signifikanten Merkmale des Häm ist, dass sie regulatorische Rolle bei der zellulären und molekularen Prozesse, wie Gen-Transkription, Proteinsynthese und Mikro RNA Biogenese 4 spielt. Beispielsweise wirkt sich die Transkription vieler Gene durch Steuerung der Aktivität von Säuger Transkriptionsrepressor BACH1 und Säugetiernuklear receptor Rev-erbα 10-15. Häm regelt die Aktivierung von Häm-Aktivatorprotein (HAP) 1, die eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Genen, die bei der Atmung und Steuerung oxidative Schädigung beteiligt spielt, in Reaktion auf Häm oder Sauerstoff 16. Häm regelt auch Gentranskription in neuronalen Zellen über den Nervenwachstumsfaktor (NGF) Signalisierungs 3,17-20. Ferner regelt die Proteinsynthese in Säugern erythroiden Zellen durch Modulierung der Aktivität des Häm-regulierten Kinase eIF2a (HRI) 21-24. Darüber hinaus beeinflussen die Aktivität des Häm Schlüsselsignalproteine ​​wie Tyrosinkinase Src Jak2 und, was für die korrekte Zellfunktion und das Zellwachstum 4,20,25 sind. Es wurde festgestellt, dass in HeLa-Zellen Häm-Hemmung bewirkt Zellzyklusarrest und die Aktivierung der Marker mit Seneszenz und Apoptose 26 verbunden. Sowohl Häm-Mangel oder ein höheres Maß an Häm sind mit schweren Auswirkungen auf die Gesundheit des Menschen 27 verbunden. Neueste Molekular einnd epidemiologische Studien haben eine positive Assoziation mit hoher Häm Aufnahme und erhöhten Risiko von Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, koronare Herzkrankheit und einige Krebsarten wie Lungenkrebs, Darmkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs 27,28 gezeigt. Mit Hilfe eines passendes Paar von normalen und Krebslungenzellen Autoren Labor haben gezeigt, dass Krebszellen Ebenen der Sauerstoffverbrauch, Häm-Synthese und Proteine ​​in Häm Aufnahme und Sauerstoffnutzung 28 beteiligten erhöht. Interessanterweise Hemmung der Häm-Synthese verringert den Sauerstoffverbrauch, Proliferation, Migration und Koloniebildung von Krebszellen 28. Somit spielt die Schwankungen der Konzentrationen von endogenem Häm eine wichtige Rolle bei der Regulation der molekularen und zellulären Prozessen 3,4,28,29. Bei Säugetieren erfolgt die Biosynthese von Häm in acht Stufen unter Einschluss von Enzymen in den Mitochondrien und im Cytosol 4 (Figur 1) befindet. Häm biosynArbeit beginnt in der Matrix der Mitochondrien mit der Kondensation von Glycin und Succinyl-CoA in der 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) zu bilden, durch ALA-Synthase (Ach) 4,31 katalysiert. Dies ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in Ham-Biosynthese in nonerythroid Zellen. 5-ALA wird dann in das Cytosol, wo die nächsten vier Schritte werden ausgeführt, um Coproporphyrinogen III (CPgenIII), die dann zurück in den Mitochondrien, wo sie in Protoporphyrin IX (PPIX) umgewandelt importiert bilden exportiert. Schließlich wird ein Molekül Eisen an den Protoporphyrin IX (PPIX) integriert, um Häm, eine Reaktion durch Ferrochelatase (FECH) 2,4 katalysiert zu produzieren. Die Höhe der Häm-Biosynthese hängt in erster Linie von der Höhe der ALAS-Enzym, die fest durch intrazelluläre Eisen und Häm 4 gesteuert wird. Die Biosynthese von Häm durch genetische Defekte, die Verfügbarkeit von bestimmten Mineralstoffen und Vitaminen (zB Riboflavin, Zink), Exposition gegenüber Toxinen (zB Aluminium, Blei betroffen), Anoxie, Fieber und Konzentration bestimmter Steroide (zB Östrogen) 32-35. Die Höhe der Häm-Synthese ist in verschiedenen krankhaften Zuständen verändert. Verringert Hämbiosynthese kann Anämie sowie neurologischen Erkrankungen 3,36 verursachen. Alternativ spielt erhöht Hämbiosynthese eine wichtige Rolle bei der Progression von bestimmten Krebs 28,37. Häm wurde gezeigt, entscheidend für das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Säuger Fettgewebe, erythroiden und neuronalen Zellen 4,38-41 sein. Zum Beispiel führt Häm Mangel an Neuriten Schaden in primären kortikalen Neuronen der Maus über die Hemmung der Glutamat-NMDA (N-Methyl-D-Aspartat) -Rezeptor-17. Zusätzlich Hemmung der Häm-Synthese verursacht programmierten Zelltod im menschlichen epithelialen Zervixkarzinom HeLa-Zellen 26,41. Daher ist es wichtig für die Untersuchung Ätiologie und progressi Messung der Häm-Biosynthese Ebenen in verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungenauf vieler Krankheiten. Hier beschreiben wir eine schnelle und empfindliche Methode, um das Niveau der intrazellulären Häm-Synthese unter Verwendung von [4- 14 C] 5-aminolevulic Säure zu messen. Dies ist ein alternatives Verfahren zu anderen Verfahren unter Verwendung von 55 Fe oder 59 Fe. Wir ziehen mit 14 C, da ihre Strahlung ist sehr schwach. Im Gegensatz dazu ist starken Schutz für die Arbeit mit Fe Isotope erforderlich. Weiterhin soll dieses Verfahren zur Messung und zum Vergleich Häm-Synthese in verschiedenen Zellen, die parallel in einer schnellen Weise. Um absolute Häm zu messen, kann man die zuvor festgelegte Verfahren, das die Verwendung von HPLC 42,43 zu verwenden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Häm dient als prosthetische Gruppe für eine große Vielfalt von Proteinen als Hämoproteine, wie Hämoglobin, Myoglobin und Cytochrom bekannt. Es wird in verschiedenen molekularen und zellulären Prozessen wie Gentranskription, Translation, Zelldifferenzierung und Zellproliferation beteiligt. Die Biosynthese von Häm Stufen variieren in verschiedenen Geweben und Zelltypen und in Krankheitszuständen wie Anämie, Neuropathie und Krebs verändert. Diese Technik verwendet [4- 14 C] 5-Aminolävulinsäure ([14 C] 5-ALA), einer der ersten Vorstufen bei der Häm-Biosyntheseweg, das Niveau der Häm-Synthese in Säugetierzellen zu messen. Dieser Assay beinhaltet die Inkubation von Zellen, die mit [14 C] 5-ALA, gefolgt von Extraktion von Häm und die Messung der Radioaktivität in Häm inkorporiert. Diese Vorgehensweise ist präzise und schnell. Bei dieser Methode wird die relative Bedeutung der Häm-Biosynthese und nicht die Gesamt Häm-Gehalt. Um die Verwendung dieser techn demonstriereniQue das Niveau der Häm-Biosynthese wurden in mehreren Säugetierzelllinien gemessen.

Dieses Verfahren wurde verwendet, um das Niveau der Häm-Synthese in normal (HBEC30KT) gegen Krebs (HCC4017) Lungenzellen zu vergleichen. 2 zeigt ein höheres Niveau der Häm-Synthese in Krebszellen (HCC4017) als normale Lungenzellen (HBEC30KT). Das Niveau der Häm-Synthese wurde auch in normalen Zellen und Krebszellen in Gegenwart von mitochondrialen Entkoppler Carbonylcyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) gemessen. Zellen wurden mit 10 uM CCCP 24 h vor der Messung Hämsynthese Ebenen behandelt. Wie erwa...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Forschung

Biologie

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Biolumineszenz-Bildgebung von HO-1 Hochregulation in der Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...