Name: measurement of heme synthesis levels in mammalian cells
Uploaded: 2015-07-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

De HCC4017 og HBEC30KT cellelinjer ble vennlig levert av Dr. John Minna laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av Cecil H. og Ida Grønne midler til Dr. Li Zhang.

FORSIKTIG: Mens han jobbet med radioaktivitet, ta nødvendige forholdsregler for å unngå forurensning av eksperimentator og omgivelsene. Disponere av alt avfall etter lokale retningslinjer strålingssikkerhet. 1. Utarbeidelse av celler <ol><li> Seed celler i 3,5 cm plater, slik at sammenflytning når 80% -90% på dagen for analysen. <ol><li> Legg merke til at såing sammenflyting for celler er avhengig av celletype og deres vekst. Ved behandling av cellene med et reagens for et bestemt a...

Heme spiller en nøkkelrolle i den generasjonen av mobilnettet energi via respirasjon 26. Altered heme metabolisme er kjent for å være assosiert med ulike sykdommer, inkludert kreft 28,41. Hemming av heme-syntesen er kjent for å forårsake cellesyklus og apoptose i Hela celler 26,41. Det er blitt vist at høy heme syntese nivå er forbundet med progresjon av lungekreftceller 28. Derfor ville det være av stor betydning for å måle nivåene av heme biosyntese i celler under...

Heme, et kompleks av toverdig jern og protoporfyrin IX er et sentralt molekyl for transport og anvendelse av oksygen i praktisk talt alle levende organismer 1-3. Den unike strukturen av heme gjør det mulig å virke som en bærer av diatomiske gasser og elektroner, samt for å utføre andre funksjoner 1-5. For eksempel, bindes heme til oksygen i hemoglobin og myoglobin for overføring og lagring av oksygen 6,7. Det fungerer også som en elektronbærer i cytochromes under respirasjon og fungerer som et elektron donor for redoksreaksjoner katalysert av cytokrom P450-enzymer 8,9. En av de mest betydningsfulle trekk ved heme er at den kan spille regulatoriske roller i cellulære og molekylære prosesser som gentranskripsjon, proteinsyntese og mikro-RNA biogenese 4. For eksempel, det påvirker transkripsjonen av mange gener ved å kontrollere aktiviteten av pattedyr transcriptional repressor bach1 og pattedyratom receptor Rev-erbα 10-15. Heme regulerer aktiveringen av heme aktivator protein (Hap) 1, som spiller en viktig rolle i aktivering av gener som er involvert i kontroll av respirasjon og oksidativ skade, i respons til heme eller oksygen 16. Heme også regulerer gentranskripsjon i nerveceller via nervevekstfaktor (NGF) signal 3,17-20. Den regulerer også proteinsyntese i pattedyr erytroide celler ved å modulere aktiviteten av heme-regulert eIF2α kinase (HRI) 21-24. Videre påvirker heme aktiviteten av nøkkelsignaleringsproteiner som tyrosinkinase JAK2 og Src, som er avgjørende for riktig funksjon og celle-cellevekst 4,20,25. Det ble funnet at i HeLa-celler heme inhibering fører til cellesyklus-stans og aktivering av markører assosiert med begynnende alderdom og apoptose 26. Både Heme mangel eller økte nivåer av heme er forbundet med alvorlige helseeffekter hos mennesker 27. Nyere molekylære ennd epidemiologiske studier har vist en positiv sammenheng med høy heme inntak og økt risiko for sykdommer, som type-2 diabetes, hjerte- og karsykdommer og flere krefttyper, inkludert lungekreft, tykktarmskreft og bukspyttkjertelkreft 27,28. Ved hjelp av en matchet par normale og kreftlungeceller forfatternes lab har funnet ut at kreftceller har økt nivå av oksygenforbruk, heme syntese og proteiner involvert i heme opptak og oksygen utnyttelse 28. Interessant, inhibering av heme syntese redusert oksygenforbruk, proliferasjon, migrering og kolonidannelse av kreftceller 28. Dermed blir svingninger i nivåene av endogent heme spiller en viktig rolle i reguleringen av molekylære og cellulære prosesser 3,4,28,29. I pattedyr, oppstår biosyntesen av heme i åtte trinn, som involverer enzymer lokalisert i mitokondriene og cytosol 4 (figur 1). Heme BiosynOppgaven begynner i matriksen i mitokondriene med kondensering av glycin og suksinyl-CoA til å danne 5-aminolevulinsyre (5-ALA), katalysert av ALA-syntase (akk) 4,31. Dette er det hastighetsbegrensende trinnet i biosyntesen heme i nonerythroid celler. 5-ALA blir deretter eksportert inn i cytosolen hvor de neste fire trinn forekommer for å danne coproporphyrinogen III (CPgenIII), som deretter er importert tilbake til mitokondriene, hvor det omdannes til protoporfyrin IX (PpIX). Til slutt blir et molekyl av jern innlemmet i protoporfyrin IX (PpIX) for å produsere heme, en reaksjon katalysert av ferrochelatase (FECH) 2,4. Graden av heme biosyntesen avhenger først og fremst av nivået på ALAS enzym som er strengt kontrollert av intracellulære jern og heme 4. Biosyntesen av heme kan påvirkes av genetiske defekter, tilgjengelighet av visse mineraler og vitaminer (for eksempel, riboflavin, sink), eksponering for giftstoffer (for eksempel, aluminium, bly), Anoksi, feber, og nivåer av visse steroider (f.eks østrogen) 32-35. Nivået av heme syntese forandres i ulike tilstander syke. Redusert heme biosyntesen kan føre til anemi samt nevrologiske sykdommer 3,36. Alternativt spiller øket heme biosyntese en viktig rolle i progresjon av visse kreftformer 28,37. Heme har vist seg å være kritisk for vekst, differensiering og overlevelse hos pattedyr adipose, erytroide og nevronale celler 4,38-41. For eksempel fører til heme mangel neurite skader i muse kortikale nevroner via inhibering av glutamat NMDA (N-metyl-D-aspartat) reseptorer 17. I tillegg hemming av heme-syntesen fører til programmert celledød i menneske epithelial cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Derfor måle heme biosyntese-nivåer i forskjellige celler under forskjellige forhold er viktig for å studere etiologi og progressipå av mange sykdommer. Her beskriver vi en rask og følsom metode for å måle nivået av intracellulær heme syntese ved å bruke [4- 14 C] 5-aminolevulic syre. Dette er en alternativ metode til andre metoder som bruker 55 eller 59 Fe Fe. Vi foretrekker å bruke 14 C fordi dens stråling er meget svak. I kontrast er sterk beskyttelse som kreves for å arbeide med Fe isotoper. Videre er denne fremgangsmåte beregnet til å måle og sammenligne heme syntese i forskjellige celler i parallell på en rask måte. For å måle absolutte heme nivåer, kan man anvende den tidligere etablerte metoden involverer bruk av HPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme tjener som protese gruppe for en rekke forskjellige proteiner kjent som hemoproteins, slik som hemoglobin, myoglobin og cytokrom. Det er involvert i ulike molekylære og cellulære prosesser som genet transkripsjon, translasjon, celledifferensiering og celleproliferasjon. Biosyntesen nivåene av heme varierer på tvers av forskjellige vev og celletyper og er endret i syke tilstander som anemi, neuropati og kreft. Denne teknikken bruker [4- 14 C] 5-aminolevulinsyre ([14C] 5-ALA), en av de tidlige forløpere i heme biosyntesebanen å måle nivåene av heme syntese i pattedyrceller. Denne analysen innebærer inkubasjon av cellene med [14C] 5-ALA, etterfulgt av ekstraksjon av heme og måling av radioaktiviteten inkorporert i heme. Denne prosedyren er nøyaktig og rask. Denne fremgangsmåten måler den relative nivåer av heme biosyntese i stedet for den totale heme-innhold. For å demonstrere bruken av dette technik nivåene av heme biosyntese ble målt på flere pattedyrcellelinjer.

Denne metoden ble anvendt for å sammenligne nivåene av heme-syntese i normal (HBEC30KT) vs. kreft (HCC4017) lungeceller. Figur 2 viser et høyere nivå av heme-syntese i kreftceller (HCC4017) enn normale lungeceller (HBEC30KT). Nivået av heme-syntese ble også målt i normale og kreftceller i nærvær av mitokondriell uncoupler karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Celler ble behandlet med 10 uM CCCP i 24 timer før målingen av heme syntese nivåer. Som forventet, vil nivået av heme-synte...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

MISSION LentiPlex Samlede shRNA Library Screening i pattedyrceller

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Visualisering av endoplasmatisk retikulum Lokalisert mRNAs i pattedyrceller

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...