Name: non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli
Uploaded: 2014-06-09T13:45:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني للبحوث المثلث MRSEC (DMR-1121107).

<ol>
	<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Chemistry+of+Biological+Free+Energy+Transduction+As+Demonstrated+by+Elastic+Protein-Based+Polymers.">Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers.</a> J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).</li><li>Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+elastin-like+protein+in+pichia+pastoris.">Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).</li><li>Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+production+of+an+elastin-like+polypeptide+by+Pichia+pastoris.">Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).</li><li>Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+elastin-like+polypeptides+with+different+transition+temperatures+by+Pichia+pastoris.">Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).</li><li>Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+synthetic+protein-based+polymer+(elastomer)+gene+in+Aspergillus+nidulans.">Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).</li><li>Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+elastin-like+polypeptide+fusions+for+expression+and+purification+of+recombinant+proteins+in+plants.">Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).</li><li>Conrad, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELPylated+anti-human+TNF+therapeutic+single-domain+antibodies+for+prevention+of+lethal+septic+shock.">ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock.</a> Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).</li><li>Kaldis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+human+interleukin-10+fusions+in+tobacco+cell+suspension+cultures.">High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures.</a> Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).</li><li>McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recursive+directional+ligation+by+plasmid+reconstruction+allows+rapid+and+seamless+cloning+of+oligomeric+genes.">Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes.</a> Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).</li><li>Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+parallel+method+for+synthesizing+DNA+repeats+enables+the+discovery+of+'smart'+protein+polymers.">A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers.</a> Nat Mater. 10, 141-148 (2011).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+effects+of+chain+length+and+concentration+on+the+thermal+behavior+of+elastin-like+polypeptides.">Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+of+Polypeptide+Inverse+Temperature+Transition+Depends+on+Mean+Residue+Hydrophobicity.">Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity.</a> Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+change+in+Gibbs+free+energy+for+hydrophobic+association+-+Derivation+and+evaluation+by+means+of+inverse+temperature+transitions.">The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions.</a> Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hofmeister+anions+on+the+phase+transition+temperature+of+elastin-like+polypeptides.">Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides.</a> The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).</li><li>Kim, B., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+actuation+of+inverse+phase+transition+of+a+stimulus-responsive+fusion+polypeptide+by+ligand+binding.">Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding.</a> J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).</li><li>Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+peptide+motifs+from+calmodulin+confer+divalent+ion+selectivity+to+elastin-like+polypeptides.">Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).</li><li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides:+biomedical+applications+of+tunable+biopolymers.">Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers.</a> Biopolymers. 94, 60-77 (2010).</li><li>McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+solid+tumors+by+elastin-like+polypeptides.">Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).</li><li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins.">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. , (2010).</li><li>Shamji, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+fusion+protein+between+thermally+responsive+elastin-like+polypeptide+and+interleukin-1+receptor+antagonist:+sustained+release+of+a+local+antiinflammatory+therapeutic.">Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic.</a> Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).</li><li>Hassouneh, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+multivalent+display+of+proteins+by+temperature+triggered+self-assembly+of+elastin-like+polypeptide+block+copolymers.">Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers.</a> Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).</li><li>Lan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+nonchromatographic+method+for+the+purification+of+recombinant+proteins+using+elastin-like+polypeptide-tagged+proteases.">An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases.</a> Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).</li><li>Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-in-one+chromatography-free+purification,+tag+removal,+and+site-specific+modification+of+recombinant+fusion+proteins+using+sortase+A+and+elastin-like+polypeptides.">Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides.</a> Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.

ELPs تقدم وسيلة غير مكلفة وخالية من اللوني تنقية عن طريق استغلال سلوكهم مرحلة التحفيز استجابة. هذا النهج يستفيد من السلوك LCST من ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج للقضاء على كل من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان بعد التعبير عن ELPs المشفرة وراثيا في E. القولونية. هذا سهولة تنقية يمكن استخدامها لإنتاج ELPs لمجموعة متنوعة من التطبيقات، أو يمكن استغلالها لتنقية الببتيدات أو البروتينات المؤتلف الذي ELP يمكن أن تكون بمثابة علامة تنقية التي يمكن إزالتها مع تجهيز تنقية آخر. ينطوي تنقية ELP الخطوات الأولية لليز E. القولونية وإزالة الجيني وغير قابلة للذوبان حطام خلية من الثقافة المحللة الخام (الشكل 1)، يليه إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية عن طريق مركز التجارة الدولية (الشكل 2). الطرد المركزي بعد إحداث التحول ELP من قبل عدينشوئها من الحرارة أو الملح يفصل ELP من الملوثات القابلة للذوبان في طاف، في خطوة توصف تدور الساخنة. بعد resolubilizing في ELP، يتم طرد الحل مرة أخرى عند درجة حرارة أقل من T ر لإزالة الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان، في خطوة توصف تدور الباردة. يدور بالتناوب الساخنة والباردة يحسن نقاء الحل ELP مع كل دورة، بتكلفة صغيرة لانتاج. غلة تنقية تختلف تبعا لELP تي تي، وطول، والببتيدات تنصهر أو البروتينات. عادة، هذا البروتوكول ينتج 100 ملغ من ELP تنقيته للتر الواحد من E. ثقافة القولونية، ولكن غلة يمكن أن تصل إلى 500 ملغ / لتر. يتم تأكيد نقاء النهائي للمنتج ELP بواسطة SDS-PAGE (الشكل 3). ميغاواط من ELP النقي يجب أن تطابق بشكل وثيق مع ميغاواط النظرية المشفرة بواسطة الجينات ELP. ومع ذلك، فإن بعض ELPs الهجرة في SDS-PAGE مع MW الظاهر أعلى تصل إلى 20٪ من MW المتوقعة على 9، 27. تحليل أكثر دقة للELPلا يمكن أن يتحقق ميجاوات بحلول MALDI-TOF-MS، والتي يمكن أيضا تقديم معلومات إضافية عن نقاء المنتج ELP جنبا إلى جنب مع التقنيات التحليلية متعامد مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC). تنقية التالية، يتم قياس ELP تي تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. هذه التقنية تراقب OD من حل ELP في حين يتم زيادة درجة الحرارة. تي تي هو تركيز تعتمد ولذلك فمن المستحسن أن تميز سلسلة تركيز ذات الصلة بتطبيق المقصود من ELP. لhomopolymers ELP الشخصى التعكر يسلك زيادة حادة واحد الذي يتوافق مع انتقال ELP من unimer المجاميع إلى ميكرون النطاق (الشكل 4A). يتم تعريف T T ودرجة الحرارة المقابلة لنقطة انعطاف في ملف تعريف التعكر، تحدد بالضبط كما الحد الأقصى للمشتقة الأولى من التطوير التنظيمي فيما يتعلق درجة الحرارة. حالة العكس منوأكد ELP المرحلة الانتقالية انخفاض في OD إلى خط الأساس كما هو خفض درجة حرارة أقل من تي تي (الشكل 4B). سوف الشخصى التعكر مع زيادة وخفض درجة الحرارة سلالم تختلف في حجمها وحركية بسبب تسوية من coacervates ELP والتباطؤ متغير ELP resolubilization. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يحمل بالمثل السلوك LCST في هذا الطريق، حيث الببتيد أو البروتين تنصهر إلى ELP يؤثر على T ر. للبروتين اندماج ELP التحول هو عكسها تحت درجة حرارة انصهار من البروتين. بينما يحددها درجة الحرارة قياس العكر هو وسيلة ممتازة لتوصيف الحرارية من المنتجات الأولية ELP، وتقنيات بديلة، مثل المسح التفاضلي قياس الكالوري (DSC)، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس ELP T ر. ELPs مع السلوكيات الحرارية أبنية المعرض أكثر تعقيدا أكثر تعقيدا التي يمكن أيضا أن تتميز درجة الحرارة PROGRAقياس العكر mmed. ELP diblock بوليمرات، على سبيل المثال، تظهر لمحة التعكر مميزة الموافق أثار درجة حرارتها التجميع الذاتي في المذيلات كروية في درجة حرارة micellization الحرجة. لمثل هذه diblock بوليمرات ELP لOD عادة أول يزيد 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس تشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وبعد ذلك زيادة حادة في التطوير التنظيمي (تصل إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس) عند درجة حرارة أعلى يدل على تشكيل ميكرون النطاق المجاميع (الشكل 5A). يتم الحصول على معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها الهياكل ELP-تسبب درجة الحرارة مع دائرة الأراضي والمساحة، وهي تقنية الذي يقيس R H المجالس ELP في الحل. التغييرات في R H توافق بشكل وثيق مع التغيرات في قياس OD مع قياس العكر (الشكل 5B). unimers ELP عادة يحمل R H &lt;10 نانومتر بينما الجمعيات جسيمات متناهية الصغر يحمل R H ~ 20-100 نانومتر والمجاميع يحمل R H </suب &gt;&gt; 500 نانومتر. معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها النانوية ELP، مثل تجميع عدد والتشكل، ويمكن الحصول على تشتت الضوء ثابتة أو المبردة المجهر الإلكتروني النافذ 17، 23، 29. نظرا لو tunability من الخواص الحرارية ELP، يتم الحصول على مجموعة من T ر ق من خلال التصاميم ELP المختلفة. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن المتأصلة T ر ستؤثر على تعظيم الاستفادة من بروتوكول تنقية لكل ELP، حيث منخفضة للغاية أو عالية T ر ق سيتطلب معظم التعديل في هذا البروتوكول القياسي. ELPs مع درجات حرارة مرتفعة للغاية تمر بمرحلة انتقالية قد تكون غير مناسبة لتنقية مع هذا النهج. إذا كان التصميم من ELPs الرواية والببتيد أو البروتين ELP اندماج قد تعرض للخطر الاستجابة الحرارية للELP، يمكن إدراج علامة بسيطة لتنقية الحامض الاميني البديلة يجمد اللوني تقارب المعادن. بالإضافة إلى ذلك،خصائص تسلسل ELP قد تتطلب تعديل هذا البروتوكول إذا اتهم بقايا ضيف. التلاعب في درجة الحموضة عازلة يمكن استخدامها كوسيلة لتغيير تهمة العام للELP في محاولة للقضاء على التفاعلات مع الملوثات كهرباء 17. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو مناسبة لظرف خاص من اندماج ELP مع الببتيدات والبروتينات عند اتخاذ التدابير المناسبة لضمان عملية تنقية لا التشويش على نشاط شاردة تنصهر. مذكرات في جميع أنحاء بروتوكول بشأن هذه التعديلات تعمل على توجيه تنقية ELPs التي قد تقدم هذه التحديات فيما يتعلق تي تي، تهمة، أو مخاوف الانصهار. تنقية ELPs عن طريق السلوك LCST بهم يقدم مقاربة بسيطة وخالية من اللوني لتنقية غالبية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج المعبر عنها في E. القولونية. بروتوكول تلخيصها هنا يسمح تنقية سو ELPs في يوم واحد باستخدام المعدات التي هي مشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا. سهولة تنقية ELPs واندماج إرادتهم، ونحن نأمل، تشجيع التنوع المتزايد من التصاميم ELP التطبيقات الجديدة في علوم المواد، والتكنولوجيا الحيوية، والطب.

الإيلاستين البروتينية مثل (ELPs) هي البوليمرات الحيوية تتألف من VPGXG خماسي الببتيد مكرر حيث X، بقايا الضيف، أي الأحماض الأمينية إلا البرولين. ELPs المعرض درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) مرحلة انتقالية السلوك، مثل أن الحل ELP متجانسة سيفصل إلى مرحلتين عند التسخين لLCST لها، وهو ما يسمى عادة درجة حرارة التحول العكسي (T ر) في الأدب ELP 1. وتتكون المرحلتين من ELP المرحلة كرية مخفف جدا ومرحلة الرواسب الغنية ELP. يتم تشكيل الرواسب الغنية ELP على فترة زمنية قصيرة على تجميع سلاسل ELP الى جزيئات ميكرون الحجم التي تتجمع في وقت لاحق. يحدث هذا السلوك على مجموعة من بضع درجات مئوية وعادة ما هو عكسها، كما يتم استرداد حل متجانسة عند عودته إلى درجة حرارة أقل من T ر. وعادة ما يتم تصنيعه في ELPs كولاي (كولاي) جيئة وذهابام الجينات الاصطناعية التي هو ligated إلى البلازميد التعبير. ثم يتم تحويل هذا البلازميد إلى E. خط الخلية القولونية التي هي الأمثل للتعبير البروتين. وقد استخدمنا حصرا النظام متجه T7 لاك حيوان أليف للتعبير عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من ELPs في E. القولونية، على الرغم من أن أنظمة التعبير الأخرى في الخميرة 2-4، الفطريات 5، والنباتات 6-8 كما تم استخدامها من قبل المحققين الأخرى. ويوجد عدد من النهج لبناء وراثيا الجينات ELP المتكررة، بما في ذلك ربط العودية الاتجاه (RDL) 9، ربط الاتجاه العودية بواسطة إعادة الإعمار البلازميد (PRE-RDL) 10، وتتداخل تمديد المتداول دائرة التضخيم (OERCA) 11. القدرة على مهندس ELPs على المستوى الجيني يتيح الفرصة لاستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف لخلق ELPs مع مجموعة متنوعة من أبنية (على سبيل المثال، وحيدة، diblocks، triblocks، الخ)، والتي يمكن زيادة إلحاق مع ظيفيةالببتيدات والبروتينات. السيطرة على المستوى الجيني يضمن أيضا أن يتم التعبير عن كل ELP مع طول الدقيق وتكوين تمليها قالب البلازميد الوراثية، وتوفير منتجات البوليمر الحيوي monodisperse تماما. الخصائص الحرارية من كل ELP تعتمد على المعلمات الجوهرية إلى البوليمر الحيوي مثل الوزن الجزيئي (MW)، وتسلسل، وكذلك العوامل الخارجية بما في ذلك تركيزه في حل وجود cosolutes الأخرى، مثل أملاح. طول ELP 12 و تكوين بقايا ضيفه 1، 13، 14 هي معلمتين متعامد في تصميم ELP التي يمكن استخدامها للسيطرة على ر T، حيث تؤدي مخلفات ضيف مسعور وأطوال سلسلة يعد في أقل تي تي، في حين ماء بقايا الضيوف وأطوال سلسلة أقصر يؤدي إلى ارتفاع T ر ق. تركيز ELP يرتبط عكسيا مع ر T، حيث من الحلول غرامتركيز آكلى لحوم البشر ELP يكون أقل T ر ق 12. نوع وتركيز الأملاح تؤثر أيضا على ELP تي تي، حيث تأثير الأملاح يتبع سلسلة هوفمايستر 15. الأنيونات Kosmotropic (الكلورين - وأعلى في سلسلة هوفمايستر) خفض ELP T ر وزيادة تركيز الملح يعزز هذا التأثير. يمكن ضبطها هذه المعايير الجوهرية وخارجي للحصول على السلوك الحراري في درجة حرارة تتراوح الهدف ما هو مطلوب لتطبيق معين من ELP. سلوك التحفيز استجابة من ELPs مفيد لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing 16، 17، 18 هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات 19 و 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما تنصهر ELPs لالببتيدات أو البروتينات على المستوى الجيني، يمكن للELP بمثابة علامة تنقية بسيطة لتوفير وسيلة غير مكلفة لتنقية دفعة من الحماسي المؤتلفالمد والجزر أو البروتينات التي لا تتطلب اللوني 21. التعديل من عملية تنقية يضمن أن نشاط بروتين الببتيد أو تنصهر إلى ELP المحافظة. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يمكن تنقية للتطبيقات التي العلامة ELP مفيد 22، 23 أو بدلا من ذلك، عندما يكون مطلوبا الببتيد مجانا أو البروتين، يمكن إدراج موقع الاعتراف البروتيني بين الببتيد أو البروتين وELP. ومن ثم يمكن تحقيق إزالة العلامة ELP بواسطة الهضم مع البروتيني حرة أو ELP الانصهار البروتيني، حيث يوفر هذا الأخير سهولة إضافية من تجهيز وجولة نهائية من تنقية ELP يمكن فصل ELP العلامة والبروتيني ELP الانصهار من الببتيد الهدف أو البروتين في خطوة واحدة 24 و 25. يصف بروتوكول باتباع الإجراء لتنقية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج عن طريق خصائصها الحرارية ويناقش التقنيات الأساسية للتميزالاستجابة الحرارية من المنتجات ELP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية المتكررة التي تظهر في مرحلة الحل درجة الحرارة أقل السلوك الحرجة التي تمر بمرحلة انتقالية، كما unimers للذوبان الموجودة تحت درجة حرارة التحول مميزة وتجميع في coacervates ميكرون النطاق فوق درجة حرارة انتقالها. تصميم البروتينية مثل الإيلاستين على المستوى الجيني يسمح بالتحكم الدقيق في تسلسلها وطول، والتي تملي خصائصها الحرارية. وتستخدم البروتينية مثل الإيلاستين في مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing، هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات، حيث درجة حرارة التحول والهندسة المعمارية من البوليمر الحيوي ELP يمكن ضبطها لتطبيق معين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن المرحلة الانتقالية درجة حرارة المحلول السلوك أقل تنتقد البروتينية مثل الإيلاستين يسمح تنقية من خلال استجابتها الحرارية، بحيث تقوصر بهم انتقائية وresolubilization يسمح إزالة كل الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبانق التالية التعبير في الإشريكية القولونية. ويمكن استخدام هذا النهج لتنقية البروتينية مثل الإيلاستين وحدها أو بوصفها أداة لتنقية الببتيد أو البروتين اندماج حيث الببتيدات أو البروتينات المؤتلف وراثيا لإلحاق به ببتيد مثل الإيلاستين يمكن تنقيته دون اللوني. يصف هذا البروتوكول تنقية البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج ويناقش تقنيات توصيف الأساسية لتقييم السلوك الحراري للمنتجات نقية ببتيد مثل الإيلاستين.

نحن هنا وصف نتائج ممثلة لتنقية وتوصيف لالمبلمر المتجانس ELP وdiblock كوبوليمر ELP. بعد 24 ساعة من التعبير في E. القولونية، يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي و lysed بواسطة صوتنة. عادة، وهو تغيير خفية في اللون يحدث بعد صوتنة، مؤكدا تحلل الخلية كافية (الشكل 1A). بعد إضافة جزيرة الأمير إدوارد، يتم جمع مكونات الجينوم والحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي، وفصل بيليه كبيرة من الملوثات غير القابلة للذوبان من ELP للذوبان في طاف (الشكل 1B). يتم تنقيته بواسطة ELP مزيد عكسية الدراجات الانتقالية (ITC)، الذي يستغل السلوك LCST لفصل ELP كلا من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان (الشكل 2) 28. يتم تشغيل المرحلة الانتقالية للELP بإضافة الحرارة و / أو الملح. النتائج الطرد المركزي في تشكيل بيليه في أسفل الأنبوب الذي يتكون من ELP لالثانية بعض الملوثات غير قابلة للذوبان (الشكل 1C). هذه الخطوة تسمى ساخنة تدور المرتجع الملوثات القابلة للذوبان في حين يتم الاحتفاظ طاف بيليه ELP ومعلق في المخزن الباردة. يتم طرد ELP resolubilized مرة أخرى في 4 درجات مئوية. هذه خطوة يطلق البرد تدور المرتجع بيليه من الملوثات غير القابلة للذوبان في حين يتم الاحتفاظ طاف تحتوي على ذوبان ELP. تكرار دورة بالتناوب يدور الساخنة والباردة يزيد من نقاء ELP، ولكن على حساب انخفاض العائد قليلا، كما يتم فقدان المتبقية ELP خلال كل جولة ITC في أنابيب الطرد المركزي وعلى نصائح ماصة. وأكد تنقية ناجحة من ELPs والببتيد أو البروتين اندماج ELP بواسطة SDS-PAGE. مأخوذة الصغيرة التي اتخذت خلال عملية تنقية تدليل على تنقية التدريجي للELP من E. المحللة القولونية. هى overexpressed ELP في E. الخام كولاي المحللة والملوثات خفض الطرافةح جولات متعاقبة من مركز التجارة الدولية (الشكل 3). المنقى ELP يظهر على شكل فرقة واحدة بالقرب من MW النظرية توقع. يتميز ELP تي تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. الملف الشخصى التعكر من المبلمر المتجانس ELP يسلك زيادة حادة في واحد OD في 350 نانومتر (ما يقرب من 2.0 وحدة فوق خط الأساس لتركيز ELP من 25 ميكرومتر) (الشكل 4A). التبريد بالاشعة التعكر تأكيد طبيعة عكسها للانتقال ELP كما ترجع OD إلى خط الأساس عندما يتم خفض درجة حرارة أقل من تي تي (الشكل 4B). ELP diblock بوليمرات يحمل لمحة التعكر أكثر تعقيدا، بالمقارنة مع المبلمر المتجانس ELPs. وOD يزيد عادة أول من 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس، وبعد ذلك الزيادات OD بشكل حاد إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس (الشكل 5A). توفير قياسات DLS المعلومات حول التغيير في R H فيما يتعلق درجة الحرارة، وشارك<html> rroborating المعلومات المكتسبة من التشكيل الجانبي التعكر (الشكل 5B). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. تنقية ELP الأولية بعد 24 ساعة من التعبير، E. القولونية يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومعلق في برنامج تلفزيوني. وهي lysed A) من قبل خلايا صوتنة، الذي يصاحبه تغير في اللون خفية مثل أن يظلم المحللة بعد صوتنة. ب) بعد إضافة PEI لاختصار الملوثات الحمض النووي، والمحللة هو طرد وفصل بيليه كبيرة من الحطام غير قابلة للذوبان من ذوبان ELP في طاف. C) هو فعل التحول ELP مع إضافة الحرارة و / أو الملح وأشكال الطرد المركزي لبيليه ELP شفافة.عنخ &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2. الدراجات التحول العكسي. ELP يتم تنقيته عن طريق السلوك LCST في الفترة من الملوثات سواء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان. بدءا المحللة ELP الغنية (1) وبفعل التحول ELP مع إضافة الحرارة و / أو الملح وELP يتم فصل بواسطة الطرد المركزي (تدور الساخنة) (2). يتم الاحتفاظ بيليه ELP (3A)، في حين يتم تجاهل طاف تحتوي على الملوثات القابلة للذوبان (3B). هو معلق على ELP في المخزن البارد (4) وطرد مرة أخرى في 4 درجات مئوية (تدور الباردة) (5). يتم تجاهل بيليه تحتوي على ملوثات غير قابلة للذوبان (6A)، في حين يتم الاحتفاظ طاف تحتوي على ذوبان ELP (6B). وتتكرر دورات بالتناوب يدور الساخنة والباردة حتى يتم الوصول إلى النقاء المطلوب، كما هو محدد معSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> تأكيد الشكل 3. تحليل SDS-PAGE منتجات تنقية ELP. تنقية الناجحة لELP بواسطة SDS-PAGE. بإفراط (overexpressed) ELP هو واضح في E. الخام المحللة القولونية بعد صوتنة (2). بعد إضافة PEI والطرد المركزي يتم الاحتفاظ ELP للذوبان إلى حد كبير في طاف (3)، على الرغم من بعض ELP فقدت في التخلص من الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان (4). طاف بعد الأولى تدور الساخن يحتوي على مستويات عالية من الملوثات القابلة للذوبان (5). طاف بعد الأولى تدور الباردة يشير الفصل جيدة من ELP من الملوثات غير قابلة للذوبان (6). دورات إضافية من الملفات الساخنة (7) وجيدور القديمة (8) إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية، على التوالي، حتى الساخنة (9) وتدور الباردة (10) supernatants النهائي يحمل أي العصابات الملوثة دخيلة، مؤكدا النقاء مرضية للمنتج ELP. هذا المبلمر المتجانس ELP، مع سلسلة من SKGPG (VGVPG) 80-Y، لديه الوزن الجزيئي المتوقع من 33.37 كيلو دالتون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> الشكل 4. توصيف ELP المبلمر المتجانس بواسطة يحددها درجة الحرارة قياس العكر. يتم تحديد ELP تي تي من خلال رصد OD في 350 نانومتر مع زيادة درجة الحرارة بمعدل 1 ° C / دقيقة. A) homopolymers ELP المعرض زيادة حادة في واحد OD أن مواطنهإيناس ر T بهم في إعطاء التركيز. B) يتم التحقق من عكس اتجاه التحول ELP من خلال رصد OD في 350 نانومتر من حل 25 μ M في حين خفض درجة الحرارة، حيث يتم تأكيد الانعكاسية التي كتبها عودة OD الى الاساس. هذا المبلمر المتجانس ELP لديه تسلسل SKGPG (VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> الرقم 5. توصيف ELP diblock كوبوليمر بواسطة قياس العكر يحددها درجة الحرارة وتشتت الضوء الحيوي. ELPs التي تخضع نانو النطاق التجميع الذاتي، مثل ELP diblock بوليمرات التي تجمع الذاتي في المذيلات كروية، يحمل ملامح التعكر أكثر تعقيدا. <stronز&gt; أ) زيادة معتدلة في التطوير التنظيمي يشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وذلك قبل الزيادة السريعة في التطوير التنظيمي الذي يشير التجميع الكامل للELP في المجاميع ميكرون على نطاق القياسات. B) DLS تأكيد السلوك يستدل من التشكيل الجانبي التعكر ل الحل عند 25 ميكرومتر من خلال توفير المعلومات حول التغيير في R H مع الاحترام لدرجة الحرارة. هنا unimer ELP لديه R H ~ 8 نانومتر ومذيلة ديه R H ~ 25 نانومتر. هذه مجموعة من البوليمرات diblock ELP لديه تسلسل GCGWPG (VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli at JoVE.com

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية التحفيز تستجيب مع التطبيقات بدءا من تنقية البروتين المؤتلف لتسليم المخدرات. يصف هذا البروتوكول تنقية وتوصيف البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج بهم من القولونية باستخدام درجة حرارة المحلول المرحلة الانتقالية السلوك أقل الحرجة كبديل بسيطة لاللوني.

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

خطوة واحدة تنقية البروتينات التوأم بكتيريا الموسومة ومجمعات منها على بكتيريا-Tactin الراتنج عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

تنقية وRefolding إلى اميلويد الألياف من (صاحب)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged المؤتلف Shadoo البروتين التعبير عن الهيئات إدراج في<em&gt; E. القولونية</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...