Name: microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Die hierin enthaltenen Meinungen und Aussagen sind die privaten Ansichten der Autoren und sind nicht als offizielle oder als die die Ansichten der Abteilung der Armee oder des Verteidigungsministeriums ausgelegt werden. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, während die Autoren Whitney A. Greene, Alberto Muñiz und Ramesh R. Kaini hielt eine Postdoctoral Research Associateship National Research Council an der USAISR. Microarray-Assays wurden durch die Greehey Kinderkrebsforschungsinstitut Microarray-Core Facility und Bioinformatik-Abteilung an der UT Health Science Center in San Antonio durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der US Army Klinische Rehabilitative Medizin Research Program (CRMRP) und Operational Military Medicine Research Program (MOMRP) unterstützt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Kultur Kulturplatten <ol><li> mTeSR1 Medien: Bereiten mTeSR1 Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Auftauen 100 ml mTeSR1 5x Ergänzung Nacht bei 4 ° C. Fügen Sie die 100 ml mTeSR1 5x Ergänzung zu 400 ml mTeSR1 Grundmedien und gut mischen. Dieses Medium wird bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen und bei -20 ° C für 6 Monate stabil. </li><li> Differenzierungsmedium: Vorbereiten Differenzierungsmedien in DMEM/F12 bis 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosä...

<ol>
	<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+regulate+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation.</a> Front Genet. 3, 191 (2012).</li><li>Romano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commentary+on+iPS+cell+biology:+Potential+applications+in+autologous+tissue+and+cell+transplantation,+development+of+new+models+for+the+study+of+human+pathological+conditions+and+drug+screening.">A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening.</a> J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).</li><li>Almeida, P. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).</li><li>Neveu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+reveals+two+distinct+p53-related+human+pluripotent+stem+cell+states.">MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states.</a> Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Qiagen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNeasy+Mini+Handbook.">miRNeasy Mini Handbook.</a> Sample and Assay Technologies. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+System+with+miRNA+Complete+Labeling+and+Hyb+Kit.">Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit.</a> Agilent Technologies. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hESCs+and+hiPSCs+in+mTESR1+and+mTESR2.">Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2.</a> Stem Cell Technologies. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths:+230+nm,+260+nm,+280+nm.">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li></ol>

Im Ergebnis dieser Bericht beschreibt die Kultur zu iPS-Zellen verwendeten Methoden, iPS-RPE und fetale RPE. RPE von iPS abgeleitet sind morphologisch und funktionell ähnlich fetale RPE. Die iPS-RPE drückt auch RPE charakteristischen Genen einschließlich RPE65, CRALBP, PEDF und LRAT 16. Zur weiteren Charakterisierung dieser Zellen wurde RNA extrahiert und dazu verwendet, Mikroarray-Analyse durchzuführen, um differentiell exprimierte miRNA identifizieren. Die Analyse der Signalintensitäten ergab, dass die...

Stammzellen haben die Fähigkeit, ohne Begrenzung der Möglichkeit, in jedem Zelltyp zu differenzieren replizieren. Die Entwicklung von Techniken, um Körperzellen in pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren hat große Aufregung in der Forschung und bei den Ärzten hervorgerufen, wie die Einführung von personalisierten Geweberegeneration ist am Horizont ein. Induzierte pluripotente Stammzellen-(iPS-Zellen) weisen die gleichen Merkmale der unbegrenzten Replikationspotential und Pluripotenz embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) unter Umgehung der ethischen Dilemmata mit WSR verbunden. Darüber hinaus wird von einem Patienten abgeleitete Stammzellen nicht stimulieren eine Immunantwort, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen therapeutischen Anwendungen 2-3 stark erhöht. Unter bestimmten Kulturbedingungen haben iPS-Zellen gezeigt worden, um in verschiedene Zelltypen in vitro, einschließlich Herzmuskelzellen, Neuronen pankreatischen Betazellen, Leberzellen und Retina-Pigmentepithel (RP unterscheidenE) 12.04. Das RPE ist eine spezialisierte Schicht pigmentierten Epithelzellen an der Rückseite der Retina, die mehrere Funktionen, die für visuelle Gesundheit und Funktion wie die Absorption von Streulicht, Phagozytose der Photorezeptoraußensegmente führt befindet, und die Verarbeitung von Retinoiden für die Herstellung der visuellen Chromophor. Dysfunktion des RPE aufgrund von Schäden oder Krankheit zutiefst betroffen Photorezeptor Gesundheit und visuellen Funktion, wie durch die blendende Krankheiten, die das Ergebnis der zugrunde liegenden RPE Pathologie wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), Stargardt-Krankheit und Retinitis pigmentosa (RP) sind belegt 13. Wirklich wirksame Behandlungen, die Vision wiederherstellen können nicht erreicht wurden, und der Ersatz der erkrankten RPE mit gesunden RPE kann die beste Option, um einen Verlust der Sehkraft 14-15 zu verhindern. RPE von iPS (iPS-RPE) abgeleitet ist eine mögliche Quelle von Zellen, die beschädigte RPE ersetzen. iPS-RPE drückt Merktic RPE Proteine ​​LRAT, CRALBP, PEDF und RPE65; zeigt die klassische stark pigmentierten hexagonalen RPE-Morphologie; und führt RPE-Funktionen wie Phagozytose, Retinoid-Verarbeitung und Sekretion von 11 - cis-Retinal 5,16. Doch bevor iPS-RPE therapeutisch genutzt werden kann, die iPS-RPE gründlich charakterisiert werden. Verständnis der Faktoren, Differenzierungs RPE regeln ist notwendig, um die Ausbeute und Reinheit der Zellen für klinische Anwendungen verwendet werden, zu verbessern. Zelldifferenzierung ist das Ergebnis stark regulierten Genexpression. Epigenetische Umbau des Genoms und die Koordination von Transkriptionsfaktoren sind für Zellschicksal Entscheidungen, die während der Differenzierung und Entwicklung 17 auftreten erforderlich. Verordnung der Nachricht RNA (mRNA) Übersetzung von microRNA (miRNA) präsentiert noch eine weitere Ebene der Regulierung, die das Schicksal der Zelle 1 betrifft. MiRNAs sind kurze, ~ 22 nt, Längen von Nukleotiden, die entweder unterdrücken ÜbersetzungBindung an die 3&#39;-UTR der mRNA oder mRNA, die für das Ziel-Abbau. MiRNAs haben in nahezu allen Geweben nachgewiesen worden, und bis heute über 2.000 einzigartigen menschlichen microRNAs im miRBase Datenbank registriert. Da miRNAs erfordern nur eine teilweise Komplementarität zu der Ziel-mRNA binden kann eine einzelne miRNA potenziell Dutzende oder Hunderte von Targets und umgekehrt zu binden, dh eine einzelne mRNA kann durch verschiedene miRNAs richtet sein. Diese Promiscuous Bindung charakteristisch erhöht drastisch die Komplexität der Regulierung sowie der Schwierigkeitsgrad der Bestimmung der Funktionen einzelner miRNAs und die jeweiligen Aufgaben in der zellulären Funktionen 18-21. Dennoch haben Studien gezeigt, dass miRNA verfeinert Genexpression während der Differenzierung durch die Beeinflussung DNA-Methylierungsstatus 17. In einer Studie mit mehr spezifisch auf die RPE, miR-204/211 wurde gezeigt, dass die epithelialen Phänotyp der RPE 22 zu fördern. Eine weitere Gruppe untersuchte die miRNA-Profilvon RPE während der Differenzierung von ES-Zellen und zeigte verschiedene Sätze von miRNA werden während des Differenzierungsprozesses 23 ausgedrückt. In der Tat kann miRNA Profile eindeutig unterscheiden Zelltypen, einschließlich ES Zellen, Vorläuferzellen und terminal differenzierte Zellen 24,25. Über 250 miRNAs in der Netzhaut exprimiert. Basierend auf diesen Studien die Hypothese auf, dass wir miRNAs eine wichtige Rolle während der Differenzierung von RPE von iPS. Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für die Differenzierung der RPE von IMR90-4 iPS-Zellen zu beschreiben, Sammlung von RNA für die Analyse von Mikroarrays und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden, iPS-Zellen zu identifizieren , iPS-RPE und fetale RPE. Gesamt-RNA wurde aus Kulturen von jedem Zelltyp extrahiert und hybridisiert mit einem Mikroarray-miRNA, die bestimmte für 1.205 menschlichen miRNAs und 144 viralen miRNAs Sonden. Die Microarray-Ergebnisse wurden vergleichend zu bestimmen, welche miRNAs differentiell zwischen den verschiedenen Zelltypen exprimiert. miRNAs mit 2-fach oder mehr-fache Veränderung der Expression wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Eine miRNA-Analyse-Software-Programm wurde verwendet, um potentielle Ziele der differentiell exprimierten miRNAs identifizieren und Mobilfunknetze durch die ausgewählten miRNAs reguliert erzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
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microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für den Vergleich der microRNA (miRNA)-Profile von Menschen verursachten-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen iPS-Zellen (iPS-RPE) abgeleitet und fetale RPE zu beschreiben. Die Protokolle beinhalten Sammlung von RNA für Microarray-Analyse durch, und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden. Die Methoden zur Kultur der iPS-Zellen und fetaler RPE erklärt. Das zur Unterscheidung von menschlichen RPE von iPS-Protokoll verwendet, ist ebenfalls beschrieben. Die RNA-Extraktion Technik, die wir beschreiben, wurde ausgewählt, um maximale Erholung von sehr kleinen RNA, die für die Verwendung in einem miRNA-Microarray zu ermöglichen. Schließlich wird zellulären Weg-und Netzwerk-Analyse von Microarray-Daten erläutert. Diese Techniken werden den Vergleich der miRNA-Profile von drei unterschiedlichen Zelltypen zu erleichtern.

IPS-Zellen (1A) in Differenzierungsbedingungen gezüchtet, um die Differenzierung in iPS-RPE-Zellen zu induzieren. Die iPS-RPE RPE zeigte klassische Phänotyp der hexagonalen pigmentierte Zellmorphologie (Abbildung 1B) ähnlich fetale RPE (Abbildung 1C). Um die Rolle der miRNA kann während der Prozess der Differenzierung von iPS zu iPS-RPE spielen, besser zu verstehen, wurde Microarray-Analyse von miRNA-Expression durchgeführt. Gesamt-RNA ...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Forschung

Biologie

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...