Name: microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell&#39;Esercito o il Dipartimento della Difesa. Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l&#39;USAISR. Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Science Center a San Antonio. Questo lavoro è stato supportato dal US Army programma clinico di Medicina Riabilitativa Research (CRMRP) e militare Programma di Ricerca Operativa Medicina (MOMRP).

1. Preparazione della Cultura Reagenti e piastre di coltura <ol><li> mTeSR1 Media: Preparare il supporto mTeSR1 secondo le istruzioni del produttore. Scongelare 100 ml di mTeSR1 5x supplemento notte a 4 ° C. Aggiungere 100 ml di mTeSR1 5x complemento a 400 ml di mTeSR1 terreni di base e mescolare bene. Questo supporto è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Differenziazione dei media: Preparare il supporto differenziazione DMEM/F12 per produrre 0.1mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoaci...

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	<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+regulate+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation.</a> Front Genet. 3, 191 (2012).</li><li>Romano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commentary+on+iPS+cell+biology:+Potential+applications+in+autologous+tissue+and+cell+transplantation,+development+of+new+models+for+the+study+of+human+pathological+conditions+and+drug+screening.">A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening.</a> J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).</li><li>Almeida, P. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).</li><li>Neveu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+reveals+two+distinct+p53-related+human+pluripotent+stem+cell+states.">MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states.</a> Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Qiagen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNeasy+Mini+Handbook.">miRNeasy Mini Handbook.</a> Sample and Assay Technologies. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+System+with+miRNA+Complete+Labeling+and+Hyb+Kit.">Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit.</a> Agilent Technologies. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hESCs+and+hiPSCs+in+mTESR1+and+mTESR2.">Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2.</a> Stem Cell Technologies. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths:+230+nm,+260+nm,+280+nm.">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li></ol>

In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l&#39;RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato ril...

Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l&#39;avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all&#39;orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non stimolare una risposta immunitaria, aumentando notevolmente la probabilità di successo applicazioni terapeutiche 2-3. Sotto specifiche condizioni di coltura, le cellule iPS hanno dimostrato di differenziarsi in diversi tipi cellulari in vitro, compresi cardiomiociti, neuroni, cellule beta pancreatiche, epatociti e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) 4-12. La RPE è uno strato specializzato di cellule epiteliali pigmentate situati nella parte posteriore della retina che svolge diverse funzioni che sono essenziali per la salute visiva e funzione come assorbimento della luce diffusa, fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, e l&#39;elaborazione di retinoidi per la produzione di chromophore visiva. Disfunzione del RPE causa di danni o malattia colpisce profondamente la salute dei fotorecettori e la funzione visiva come testimoniano le malattie accecante che sono il risultato della sottostante patologia RPE come la degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD), la malattia di Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Trattamenti veramente efficaci che possono ripristinare la visione non sono stati raggiunti, e la sostituzione di RPE malato con sano RPE può essere l&#39;opzione migliore per prevenire la perdita della visione 14-15. RPE derivate da iPS (iPS-RPE) è una possibile fonte di cellule per sostituire il RPE danneggiato. iPS-RPE esprime caratteristiproteine ​​RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; visualizza la classica altamente pigmentato esagonale RPE morfologia; e svolge funzioni RPE come la fagocitosi, l&#39;elaborazione retinoidi, e la secrezione di 11 - cis 5,16 retinica. Tuttavia, prima di iPS-RPE può essere utilizzato terapeuticamente, IPS-RPE deve essere accuratamente caratterizzato. Comprensione dei fattori che regolano la differenziazione RPE è necessario per migliorare la resa e la purezza delle cellule da utilizzare per applicazioni cliniche. La differenziazione cellulare è il risultato dell&#39;espressione genica altamente regolato. Rimodellamento epigenetico del genoma e del coordinamento dei fattori di trascrizione sono necessari per le decisioni destino delle cellule che si verificano durante la differenziazione e lo sviluppo 17. Regolamento del messaggio RNA messaggero (mRNA), traduzione di microRNA (miRNA) presenta ancora un altro livello di regolamentazione che riguarda il destino delle cellule 1. MiRNAs sono brevi, ~ 22 nt, lunghezze di nucleotidi che sia la traduzione di soppressione dalegame al 3 &#39;UTR del mRNA bersaglio o l&#39;mRNA per degradazione. MiRNAs sono stati rilevati in quasi tutti i tessuti e ad oggi oltre 2.000 microRNA umani unici sono stati registrati nel database miRBase. Poiché miRNA richiedono complementarità soltanto parziale di legarsi al mRNA bersaglio, un singolo miRNA può potenzialmente legarsi a decine o centinaia di bersagli, e viceversa, cioè un singolo mRNA può essere bersaglio di diversi miRNA diversi. Questa caratteristica vincolante promiscua aumenta notevolmente il livello di complessità della regolamentazione, così come il livello di difficoltà di determinare le funzioni dei singoli miRNA e il ruolo ognuno gioca in funzioni cellulari 18-21. Tuttavia, studi hanno dimostrato che miRNA raffina genica durante il differenziamento influenzando stato di metilazione del DNA 17. In uno studio più specifico al RPE, miR-204/211 ha dimostrato di promuovere il fenotipo epiteliale della RPE 22. Un altro gruppo ha analizzato il profilo di miRNAdi RPE durante il differenziamento di cellule ES e ha rivelato insiemi distinti di miRNA sono espressi durante il processo di differenziazione 23. In realtà, i profili miRNA possono distinguere in modo inequivocabile tipi cellulari, comprese le cellule staminali, cellule precursori e cellule terminalmente differenziate 24,25. Oltre 250 miRNA sono espressi nella retina. Sulla base di questi studi, ipotizziamo che i microRNA svolgono un ruolo importante durante la differenziazione di RPE da iPS. L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per il differenziamento di RPE da IMR90-4 cellule iPS, la raccolta di RNA per l&#39;analisi mediante microarray e l&#39;analisi dei dati di microarray per identificare miRNA che sono differenzialmente espressi fra tre tipi di cellule, le cellule iPS , iPS-RPE e RPE fetale. L&#39;RNA totale è stato estratto da colture di ogni tipo di cellula e ibridato a un microarray miRNA, contenente sonde specifiche per il 1205 miRNA umani e 144 miRNA virali. I risultati microarray sono stati confrontanod per determinare quali miRNA sono differenzialmente espressi tra i diversi tipi cellulari. miRNA con 2 volte o più fold change in espressione sono stati selezionati per ulteriore analisi. Un programma software di analisi miRNA è stato usato per identificare potenziali target dei miRNA differenzialmente espressi e generare reti cellulari regolati dai miRNA selezionati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l&#39;analisi mediante microarray e l&#39;analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell&#39;RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l&#39;uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.

cellule iPS (Figura 1A) sono state coltivate in condizioni di differenziazione di indurre il differenziamento in cellule iPS-RPE. IPS-RPE esposto classico fenotipo RPE di esagonale morfologia cellulare pigmentato (Figura 1B) simile a RPE fetale (Figura 1C). Per comprendere meglio il ruolo che può svolgere miRNA durante il processo di differenziazione da iPS a iPS-RPE, analisi di microarray di espressione dei miRNA è stata condotta. L&#39;R...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Ricerca

Biologia

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Generazione efficiente e coerente di epitelio/coroide pigmentato retinico Flatmounts da occhi umani per analisi istologiche

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...