Name: stimulation of cytoplasmic dna sensing pathways in vitro and in vivo
Uploaded: 2014-09-18T13:00:00
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Die Autoren haben keine Bestätigungen.

1. Concatemerisierungsreaktion <ol><li> Resuspendieren Primer Fw und Rv (siehe Tabelle der Materialien für die Primer-Sequenzen) zu einer Konzentration von 10 ug / ul in die Molekularbiologie H 2 O. Dann mischen 5 ul FW und 5 ul Primer Rv in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Glühen Zündmittelmischung durch Erhitzen auf die richtige Anlagerungstemperatur (75 ° C für die hier beschriebenen Primer) für 15 min. Lassen Sie auf der Bank, um bei Raumtemperatur (RT) abkühlen. Bereiten Sie den...

<ol>
	<li>Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+anemia+caused+by+interferon-beta+produced+in+mouse+embryos+carrying+undigested+DNA.">Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA.</a> Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).</li><li>Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+regulates+intracellular+DNA-mediated,+type+I+interferon-dependent+innate+immunity.">STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity.</a> Nature. 461, 788-792 (2009).</li><li>Ishii, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TANK-binding+kinase-1+delineates+innate+and+adaptive+immune+responses+to+DNA+vaccines.">TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines.</a> Nature. 451, 725-729 (2008).</li><li>Stetson, D. B., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+cytosolic+DNA+activates+an+IRF3-dependent+innate+immune+response.">Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response.</a> Immunity. 24, 93-103 (2006).</li><li>Pichlmair, A., Reise Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+recognition+of+viruses.">Innate recognition of viruses.</a> Immunity. 27, 370-383 (2007).</li><li>Unterholzner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFI16+is+an+innate+immune+sensor+for+intracellular+DNA.">IFI16 is an innate immune sensor for intracellular DNA.</a> Nat. Immunol. 11, 997-1004 (2010).</li><li>Ferguson, B. J., Mansur, D. S., Peters, N. E., Ren, H., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PK+is+a+DNA+sensor+for+IRF-3-dependent+innate+immunity.">DNA-PK is a DNA sensor for IRF-3-dependent innate immunity.</a> Elife. 1, e00047 (2012).</li><li>Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+GMP-AMP+synthase+is+a+cytosolic+DNA+sensor+that+activates+the+type+I+interferon+pathway.">Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway.</a> Science. 339, 786-791 (2013).</li><li>Honda, K., Taniguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRFs:+master+regulators+of+signalling+by+Toll-like+receptors+and+cytosolic+pattern-recognition+receptors.">IRFs: master regulators of signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 644-658 (2006).</li><li>Karayel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR-independent+DNA+recognition+pathway+in+murine+macrophages:+Ligand+features+and+molecular+signature.">The TLR-independent DNA recognition pathway in murine macrophages: Ligand features and molecular signature.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1929-1936 (2009).</li></ol>

Die hier beschriebenen Protokolle werden verwendet, um dsDNA zu erzeugen, um die cytosolische angeborenen Immunantwort mit reproduzierbaren Ergebnissen in einer Vielzahl von Zelltypen in vivo zu stimulieren. Da das Hauptsubstrat Reagenz verwendet wird, ist ein synthetisches Oligonukleotid, es ist die Flexibilität dieses Systems für die alternative DNA-Sequenzen oder chemische Modifikationen. Es ist möglich, zum Beispiel, um die in diesem Protokoll mit einem, der eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Biotin-Ein...

DNA ist ein wichtiger Bestandteil aller Organismen und Zellen, die Eukaryoten halten in bestimmten Fächern. Eine Funktion des angeborenen Immunsystems ist es, festzustellen, wann solche Kompartimentierung bricht oder wenn Fremdkörper in den Organismus über eine Verletzung der körperlichen, externe Barrieren eingeführt. Im menschlichen Körper gibt es eine Reihe von Proteinen, zu helfen verschlechtern kleinen DNA-Mengen, die die korrekte Kompartimentierung entweichen kann existieren; DNAse I, II, und III brechen DNA im Plasma, Endosomen und Cytosol sind. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Mäuse ohne DNAse II sterben an schweren Anämie, die durch übermäßige Produktion von Interferonen 1 was darauf hindeutet, dass verursacht das angeborene Immunsystem reagiert auf Extra-Kern-DNA. Diese Reaktion tritt auch in Mäusen, die in Toll-like-Rezeptor-Signal Kapazität völlig unzulänglich sind. Zahlreiche Studien haben jetzt, dass Stimulator der Interferon-Gene (STING) 2 und TANK-binding kinase 1 (TB gezeigtK1) 3 in der Detektion von DNA in das Cytoplasma und dass dieser Signalweg aktiviert, Interferon Regulatory Factor (IRF) -3 4 beteiligt. Die anschließende IRF3-abhängige Transkription von Zytokin-Chemokin-und Interferon-Gene ist charakteristisch für einen angeborenen Immunantwort, entweder einen Erreger oder Gefahr assoziierte molekulare Muster (PAMP oder DAMP) 5. Der Wunsch, die intrazelluläre Signalwege Nucleinsäuredetektion Studie hat zu der Forderung geführt, um robuste und reproduzierbare Verfahren zur Stimulierung Zellen durch die Einführung von DNA oder RNA in Zellen ohne Aktivierung anderen angeborenen Immunantwort zu entwickeln. Eine Methode, durch die der Sting / TBK1 / IRF3 Wegs stimuliert werden kann durch Verwendung von kationischen Lipid-Transfektionsreagenzien Nukleinsäure in das Cytoplasma, wo sie von DNA-Sensoren, wie DNA-PK, IFI16 und CGAS 6-8 zugänglich zu liefern. Die Eigenschaften der DNA, die derzeit verstanden werden eff ermöglicheniziente Aktivierung der cytoplasmatischen angeborenen Immunantwort ohne Stimulation anderer Wege sind die Länge, Masse, Reinheit und das Fehlen von CpG-Motiven 4,7,9. Synthetische Oligonukleotide eignen sich für die Zwecke der Erzeugung einer angeborenen Immunantwort, wie sie es dem DNA-Sequenz optimiert und als reine chemische Spezies hergestellt werden. Ein 45-Basenpaar-immunstimulatorischen DNA (ISD)-Sequenz wurde durch Stetson et al. 4 als geeignetes, CpG-freie Sequenz für diesen Zweck identifiziert. Diese dsDNA-Sequenz ist ansonsten zufällig und hat keine spezifischen Funktionen, die über ihren Mangel an CpG-Motive. Wir haben gefunden, daß durch concatemerizing ISD Oligonukleotids in deutlich längeren Stränge erhöht die Größe der Stimulations 7. Generation von concatemerized ISD ist daher nützlich für die Förderung einer zytoplasmatischen angeborenen Immunantwort. Hier präsentieren wir Protokolle zur Herstellung dieses Reagenz und wie sie verwendet werden, um die DNA Messweges in aktivierenvitro als auch in vivo. HINWEIS: Alle Tierversuche genehmigt werden unter institutionellen Protokolle und Tierpflege-Richtlinien durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Forward Primer</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td style="width:407px;">TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:295px;">Reverse Primer</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">PEG8000</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">P-4463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:221px;">Promega</td>
			<td style="width:144px;">M4101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:221px;">Promega</td>
			<td style="width:144px;">M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol:Chloroform</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:144px;">BPE1752p-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Chloroform</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:144px;">C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ethanol</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">DNA gel loading buffer</td>
			<td style="width:221px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:144px;">B7021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">Bioline</td>
			<td style="width:144px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Optimem</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Mirus Bioscience</td>
			<td style="width:144px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hamilton Syringe</td>
			<td style="width:221px;">Hamilton</td>
			<td style="width:144px;">80901 Model 1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">30G needles&#160;</td>
			<td style="width:221px;">BD bioscience</td>
			<td style="width:144px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen</td>
			<td style="width:144px;">74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligo(dT) primer</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:144px;">SO131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:221px;">Fermentas</td>
			<td style="width:144px;">R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Super Script III reverse transcriptase</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:144px;">56575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">First strand cDNA synthesis buffer</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">y02321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SybrGreen qPCR Fast master mix</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:144px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">cxcl10 murine forward primer&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>ACTGCATCCATATCGATGAC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">cxcl10 murine reverse primer</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>TTCATCGTGGCAATGATCTC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">il6 murine forward primer&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">il6 murine forward primer&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stimulation of cytoplasmic dna sensing pathways in vitro and in vivo

Um effizient eine angeborene Immunantwort zu stimulieren, müssen DNA von ausreichender Länge und Reinheit sein. Wir stellen ein Verfahren, bei dem Doppelstrang-DNA (dsDNA), das die erforderlichen Eigenschaften hat, um die cytoplasmatischen DNA Erfassungswege kann kostengünstig und mit Leichtigkeit erzeugt werden stimulieren. Vom Concatemerisierungsreaktion von kurzen, synthetischen Oligonukleotiden (die CpG-Motive fehlen), können dsDNA erzeugt werden, um eine ausreichende Länge aufweisen, um die cytosolische DNA Erfassungspfad zu aktivieren. Dieses Protokoll beinhaltet Ligation stumpfer Enden der Oligonukleotide in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG), der eine Umgebung für effiziente Ligation statt bietet. Die dsDNA Concatemeren verwendet werden kann, nach der Reinigung durch Phenol / Chloroform-Extraktion, um die angeborene Immunantwort in vitro durch Standard Transfektionsprotokolle simulieren. Diese DNA kann auch verwendet werden, um angeborene Immunität in vivo durch intradermale Injektion in die Ohrmuschel der Maus zu stimulieren, zum Beispiel. DurchStandardisierung der Concatemerisierungsreaktion Prozess und die anschließende Stimulationsprotokolle kann eine zuverlässige und reproduzierbare Aktivierung des angeborenen Immunsystems produziert werden.

<html> Die Ergebnisse zeigen, dass unter concatemerized DNA relativ leicht erzeugt werden kann und fähig ist, die Stimulierung eine robuste angeborene Immunantwort in Zellen und in Mäusen. Mit der Verwendung von PEG8000 ist deutlich zu sehen, daß die Länge der DNA erzeugt wird, wesentlich länger ist und gleich zu induzieren Transkription von CXCL10. Wie durch Agarose-Gel-Analyse ersichtlich, weist die Standard Concatemerisierungsreaktion Längen der DNA bis zu 800 Basenpaaren (bp), während bei der Probe mit PEG8000...

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Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em

Das Ziel des Protokolls ist es, die optimalen Methoden zur Stimulierung der cytoplasmatischen DNA Erfassungswege in Zellen und in vivo zu verwenden. Dies wird durch die Verbesserung der Erzeugung von langen, doppelsträngigen DNA während blunt-end Ligation erreicht. Zellen oder Mäuse werden dann unter Verwendung einer Lipid Transfektionsreagenz transfiziert.

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Forschung

Biologie

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

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DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

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Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

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Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

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Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

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Die c-fos-Protein Immunohistologische Nachweis: Ein nützliches Werkzeug als Marker der Mittelwegen beteiligt sind in spezifischen physiologischen Antworten<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

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