Name: stimulation of cytoplasmic dna sensing pathways in vitro and in vivo
Uploaded: 2014-09-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Författarna har inga bekräftelser.

1. Concatemerization <ol><li> Resuspendera primers Fw och Rv (se tabell i Material primersekvenser) till en koncentration av 10 mikrogram / ​​l inom molekylärbiologi klass H 2 O. Därefter blandas 5 pl av Fw och 5 pl av Rv-primer i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. </li><li> Anneal primer mix genom uppvärmning till rätt hybridiseringstemperatur (75 ° C för de primrar som beskrivs här), för 15 min. Låt på bänken svalna i rumstemperatur (RT). Förbered 60% PEG8000 under denna inkubation genom uppl?...

<ol>
	<li>Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+anemia+caused+by+interferon-beta+produced+in+mouse+embryos+carrying+undigested+DNA.">Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA.</a> Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).</li><li>Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+regulates+intracellular+DNA-mediated,+type+I+interferon-dependent+innate+immunity.">STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity.</a> Nature. 461, 788-792 (2009).</li><li>Ishii, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TANK-binding+kinase-1+delineates+innate+and+adaptive+immune+responses+to+DNA+vaccines.">TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines.</a> Nature. 451, 725-729 (2008).</li><li>Stetson, D. B., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+cytosolic+DNA+activates+an+IRF3-dependent+innate+immune+response.">Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response.</a> Immunity. 24, 93-103 (2006).</li><li>Pichlmair, A., Reise Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+recognition+of+viruses.">Innate recognition of viruses.</a> Immunity. 27, 370-383 (2007).</li><li>Unterholzner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFI16+is+an+innate+immune+sensor+for+intracellular+DNA.">IFI16 is an innate immune sensor for intracellular DNA.</a> Nat. Immunol. 11, 997-1004 (2010).</li><li>Ferguson, B. J., Mansur, D. S., Peters, N. E., Ren, H., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PK+is+a+DNA+sensor+for+IRF-3-dependent+innate+immunity.">DNA-PK is a DNA sensor for IRF-3-dependent innate immunity.</a> Elife. 1, e00047 (2012).</li><li>Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+GMP-AMP+synthase+is+a+cytosolic+DNA+sensor+that+activates+the+type+I+interferon+pathway.">Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway.</a> Science. 339, 786-791 (2013).</li><li>Honda, K., Taniguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRFs:+master+regulators+of+signalling+by+Toll-like+receptors+and+cytosolic+pattern-recognition+receptors.">IRFs: master regulators of signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 644-658 (2006).</li><li>Karayel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR-independent+DNA+recognition+pathway+in+murine+macrophages:+Ligand+features+and+molecular+signature.">The TLR-independent DNA recognition pathway in murine macrophages: Ligand features and molecular signature.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1929-1936 (2009).</li></ol>

De protokoll som beskrivs här används för att generera dsDNA att stimulera cytosoliskt medfödda immunsvar med reproducerbara resultat i en rad olika celltyper och in vivo. Eftersom huvud substratreagenset som används är en syntetisk oligonukleotid, det finns flexibilitet i detta system för att använda alternativa DNA-sekvenser eller kemiska modifieringar. Det är möjligt, till exempel, för att ersätta den främre strängen oligonukleotiden beskrivs i detta protokoll med en som innehåller en fluoresc...

DNA är en viktig komponent i alla organismer och celler, vilka eukaryoter hålla i särskilda fack. En funktion av det medfödda immunförsvaret är att identifiera när en sådan uppdelning går sönder eller när främmande material införs i organismen via en överträdelse av fysiska, yttre hinder. I människokroppen finns det ett antal proteiner som finns för att hjälpa bryta ned små mängder DNA som kan komma rätt uppdelning; DNAs I, II och III bryta ned DNA i plasma, endosomen, och cytosol, respektive. Det har dock visat sig att möss som saknar DNAse II dör av svår blodbrist som orsakas av överproduktion av interferoner 1 tyder på att det medfödda immunförsvaret reagerar på extra-nukleärt DNA. Detta inträffar även hos möss som är helt saknar toll-liknande kapacitet receptorsignalering. Ett stort antal studier har nu visat att stimulator av interferongener (STING) 2 och TANK-bindande kinas 1 (TBK1) 3 är involverade vid detektering av DNA i cytoplasman och att denna signalväg aktiverar interferonreglerande faktor (IRF) -3 4. Den efterföljande IRF3 beroende transkription av cytokin, kemokin och interferongener är kännetecknande för en medfödd immunsvar mot antingen en patogen eller fara molekylära mönster (PAMP eller DAMP) 5. Viljan att studera intracellulära nukleinsyra kännande vägar har lett till krav på att utveckla robusta och reproducerbara metoder för att stimulera celler genom att införa DNA eller RNA i celler utan att aktivera andra medfödda immunsvar. En metod som STING / TBK1 / IRF3 vägen kan stimuleras är att använda katjoniska lipid transfektionsreagens att leverera nukleinsyra i cytoplasman där den kan nås av DNA-sensorer såsom DNA-PK, IFI16 och cgas 6-8. Egenskaperna hos DNA, som för närvarande förstås att medge efficient aktivering av cytoplasma medfödda immunsvar utan stimulering av andra vägar är dess längd, vikt, renhet och avsaknad av CpG-motiv 4,7,9. Syntetiska oligonukleotider är mycket lämpliga i syfte att alstra en medfödd immunsvar som de tillåter den DNA-sekvens, som skall optimeras och framställd som en ren kemisk art. En 45 baspar immuno-stimulatoriska DNA (ISD) sekvensen identifierades genom Stetson et al. Fyra som en lämplig, CpG-fri sekvens för detta syfte. Denna dsDNA sekvens är annars slumpmässig och har inga särskilda egenskaper utöver sin brist på CpG-motiv. Vi har funnit att genom concatemerizing ISD oligonukleotiden i signifikant längre strängarna ökar magnituden av stimuleringen 7. Generering av concatemerized ISD är därför användbart för att stimulera en cytoplasmatisk medfödda immunsvar. Här presenterar vi protokoll för att förbereda detta reagens och hur den kan användas för att aktivera DNA avkänning vägenvitro såväl som in vivo. OBS: Alla djurförsök utförs under godkända institutionella protokoll och riktlinjer djurvårds.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Forward Primer</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td style="width:407px;">TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:295px;">Reverse Primer</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">PEG8000</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">P-4463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:221px;">Promega</td>
			<td style="width:144px;">M4101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:221px;">Promega</td>
			<td style="width:144px;">M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Phenol:Chloroform</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:144px;">BPE1752p-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Chloroform</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:144px;">C/4960/PB08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ethanol</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">DNA gel loading buffer</td>
			<td style="width:221px;">New England biolabs</td>
			<td style="width:144px;">B7021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">Bioline</td>
			<td style="width:144px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Optimem</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Mirus Bioscience</td>
			<td style="width:144px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hamilton Syringe</td>
			<td style="width:221px;">Hamilton</td>
			<td style="width:144px;">80901 Model 1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">30G needles&#160;</td>
			<td style="width:221px;">BD bioscience</td>
			<td style="width:144px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rneasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen</td>
			<td style="width:144px;">74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Oligo(dT) primer</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:144px;">SO131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:221px;">Fermentas</td>
			<td style="width:144px;">R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Super Script III reverse transcriptase</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:144px;">56575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">First strand cDNA synthesis buffer</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:144px;">y02321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SybrGreen qPCR Fast master mix</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:144px;">4385612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">cxcl10 murine forward primer&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>ACTGCATCCATATCGATGAC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">cxcl10 murine reverse primer</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>TTCATCGTGGCAATGATCTC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">il6 murine forward primer&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">il6 murine forward primer&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Integrated DNA technologies</td>
			<td style="width:144px;">n/a</td>
			<td>GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stimulation of cytoplasmic dna sensing pathways in vitro and in vivo

För att effektivt stimulera ett inneboende immunsvar, måste DNA vara av tillräcklig längd och renhet. Vi presenterar en metod där dubbelsträngat DNA (dsDNA), som har de egenskaper som krävs för att stimulera cytoplasma DNA kännande vägar kan genereras billigt och enkelt. Förre concatemerization av korta, syntetiska oligonukleotider (vilka saknar CpG-motiv) kan dsDNA genereras för att ha tillräcklig längd för att aktivera den cytosoliska DNA avkänning vägen. Detta protokoll involverar trubbig ände-ligering av oligonukleotiderna i närvaro av polyetylenglykol (PEG), som tillhandahåller en miljö för effektiv ligering skall ske. De dsDNA konkatemerer kan användas, efter rening genom fenol / kloroform-extraktion, för att simulera det medfödda immunsvar in vitro genom vanliga transfektions-protokoll. Detta DNA kan också användas för att stimulera det medfödda immunförsvaret in vivo genom intradermal injektion i ytterörat hos en mus, till exempel. Genomstandardisera concatemerization processen och de efterföljande stimuleringsprotokoll, kan produceras en tillförlitlig och reproducerbar aktivering av det medfödda immunsystemet.

<html> Resultaten nedan indikerar att concatemerized DNA kan genereras med relativ lätthet och är i stånd att stimulera en robust medfödda immunsvar i celler och i möss. Med användning av PEG8000, kan det tydligt ses att längden av DNA som genereras är betydligt längre och lika med förmåga att inducera transkription av Cxcl10. Såsom framgår med agarosgelanalys, har standarden concatemerization längder av DNA av upp till 800 baspar (bp), medan för provet med PEG8000, längden av DNA innefattar strängarna ?...

Watch this Scientific Journal Video about Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulering av Cytoplasmatiska DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em

Syftet med protokollet är att använda optimala metoder för att stimulera de cytoplasmiska DNA kännande vägar i celler och in vivo. Detta uppnås genom att förbättra alstringen av långa, dubbelsträngade DNA under trubbig ände-ligering. Celler eller möss transfekteras sedan med användning av en lipid transfektion reagens.

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

In vitro och in vivo mareld Reporter Gene avbildning av mänskliga embryonala stamcellslinjer

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo och in vitro studier av Adapter-clathrin Interaktion

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisering av MG53-medierad cellmembranet reparera med hjälp av In vivo Och In vitro System

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistological Detection: ett användbart verktyg som en markör centralbanks involverade i specifika fysiologiska reaktioner<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; Ex vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Uppmätt mätning av glukos och reaktion på insulinstimulering i<em&gt; In Vitro</em&gt; Odlade humana primära myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...