Name: the sciatic nerve cuffing model of neuropathic pain in mice
Uploaded: 2014-07-16T15:00:00
Duration: 7 min 9 s
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Este trabajo fue apoyado por el Centre National de la Recherche Scientifique (UPR3212 contrato), la Universidad de Estrasburgo y por un NARSAD Young Investigator Beca de la Fundación de Investigación del Cerebro y Comportamiento (a IY). Los costos de publicación son soportados por la red Neurex (Programa Interreg IV Alto Rin).

Protocolos han sido aprobados por el &quot;comité d&#39;éthique en Materia de expérimentation animale de Strasbourg&quot; (CREMEAS). 1. Medición de línea de base de la pata del Retiro Umbrales <ol><li> Permitir a los ratones para habitúan a las instalaciones de los animales durante al menos 10 días a 2 semanas antes de iniciar los procedimientos de prueba. </li><li> Habituar a los ratones a la de von Frey prueba puesta a punto y con el procedimiento de von Frey, que se describen en la sección 4. </li><li> Antes de la cirugía, evaluar los umbrales de retirada de la pata mecánicos con filamentos de von Frey como se describe en la sección 4.3. Nota: Repita el procedimiento en días separados hasta que se obtengan al menos tres valores consecutivos estables para los umbrales de retirada de la pata. </li><li> Asignar los ratones a los diferentes grupos experimentales de modo que estos grupos no difieren inicialmente para los umbrales de retirada de la pata. </li></ol> 2. Procedimiento de Cirugía en Cuff Implantatien <ol><li> Pesar el animal. Nota: Ratón peso corporal debe ser mayor de 20 g para el procedimiento de inserción del manguito se describe a continuación. </li><li> Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de 4 ml / kg de una mezcla de ketamina (17 mg / ml) y xilazina (2.5 mg / ml) en 0,9% de NaCl, que proporciona alrededor de 45 min de la anestesia. </li><li> Compruebe la ausencia de reflejos pata pellizcando una pata trasera con pinzas y comprobar la ausencia de reflejos del ojo para asegurarse de que el animal esté totalmente anestesiado. </li><li> Afeitarse la pierna derecha desde la rodilla hasta la cadera utilizando una máquina de afeitar eléctrica. </li><li> Aplique el gel líquido ocular de protección para los ojos con un bastoncillo de algodón. </li><li> Colocar el animal sobre su lado izquierdo y coloque la extremidad posterior derecha en una pequeña almohada y mantener la extremidad posterior derecha de la almohada con cinta adhesiva. </li><li> Desinfectar el campo de la cirugía con clorhexidina y etanol al 70% utilizando una gasa o un hisopo con punta de algodón. </li><li> Encuentra el fémur con el dedo índice y hacer unaincisión de aproximadamente 0,5 cm, paralela al fémur y aproximadamente 1,5 mm anterior al fémur. </li><li> Separe los músculos cercanos al fémur con dos palos tratado al autoclave. Notas: Nunca corte el músculo. Normalmente, las capas musculares se separan fácilmente sin ningún tipo de sangrado y el nervio ciático es entonces visible. En caso de sangrado, use un hisopo con punta de algodón estéril para absorber la sangre. </li><li> Inserte dos palos en autoclave por debajo del nervio ciático para exponer su rama principal, e hidratar el nervio con una solución fisiológica estéril (0,9% NaCl). </li><li> Mantenga la sección 2 mm estéril previamente preparada de la tubería de división de PE-20 de polietileno (manguito), 0,38 mm de DI / 1,09 mm de diámetro exterior, con la ayuda de un palo de acero en punta y una pinza bulldog. <ol><li> Inserte el dispositivo de acero con punta en el manguito, que ligeramente lo abrirá. </li><li> Uso de la abertura lateral del manguito, inserte el bulldog en un extremo de la muñequera y paralelo a la banda. Gire el bulldog (180 °) para que se sostenga el manguito por ellado que es opuesto a la abertura lateral. Cierre el bulldog y retire el palillo de acero con punta. Nota: la rotación se hace para permitir la celebración-en el manguito en una posición óptima para la inserción, la pinza bulldog también está ayudando a mantener el manguito parcialmente abierta. El modelo y el tamaño de la pinza bulldog son críticos para este paso del procedimiento. </li></ol></li><li> Tener un segundo experimentador mantener los dos palos bajo el nervio y suavemente separar los palos para facilitar el acceso a una sección del nervio ciático que es de alrededor de 4 mm de largo. </li><li> Insertar el manguito 2 mm alrededor de la rama principal del nervio ciático, empezando por la inserción de la parte del manguito que es distal a la bulldog alrededor de la parte del nervio que es proximal a la cadera. </li><li> Cierre el manguito suavemente ejerciendo presión sobre sus dos lados distales con alicates, sin apretar o cambiar la forma del tubo. Gire el manguito para asegurarse de que está bien cerrada. </li><li> Suture el ingenio capa de piel afeitadah nudos quirúrgicos. </li><li> Coloca el ratón sobre su lado izquierdo en una jaula limpia. Mantenerlo bajo la lámpara de calor hasta que el ratón está despierto. </li><li> Añadir más agua y colocar algo de comida directamente en su jaula. </li></ol> 3. Procedimiento de Cirugía en controles simulados <ol><li> Aplique el mismo procedimiento de la cirugía tal como se describe más arriba desde el paso 2.1 al paso 2.9, a continuación, siga con los pasos 2.15 a 2.17. Para los controles sham, omita los pasos 02.10 a 02.14 que sólo afectan a la inserción del manguito. </li></ol> 4. Von Frey Pruebas <ol><li> Coloca los ratones en cajas individuales transparentes (7 cm x 9 cm x 7 cm) con agujeros, en una placa perforada elevado de acero inoxidable liso (1 mx 50 cm, 5 mm perforaciones circulares con 2,5 mm entre las fronteras de perforación). Nota: Hasta 12 ratones se pueden probar de forma concomitante en esta configuración. Animales operados se pueden probar al día siguiente de la cirugía. Sin embargo, se recomiendan 3 días de recuperación para disminuir la hipersensibilidad después de la cirugía se observa encontroles simulados. </li><li> Permitir que los animales se habitúan durante 15 minutos antes de la prueba. </li><li> Aplicar los filamentos de von Frey a la superficie plantar de cada pata trasera en una serie de fuerzas ascendentes. Notas: Los filamentos de von Frey pelos son de plástico de diámetros calibrados. Son 5 cm de largo y se fijan en aplicadores manuales. La velocidad de aplicación de filamento, el grado de flexión y la duración de la aplicación puede influir en los valores de umbral que se obtienen con esta prueba 3. Con el presente procedimiento en ratones, los filamentos que son los utilizados con más frecuencia son la 0.16, 0.4, 0.6, 1, 1.4, 2, 4, 6, 8 y 10 g. <ol><li> Aplicar el filamento elegido a la superficie plantar de la pata izquierda hasta que el filamento sólo se dobla. Repita el procedimiento de tres a cinco veces consecutivas, y luego hacer lo mismo con la pata derecha. Una vez que el filamento se ha probado en ambas patas, probar el siguiente animal. Notas: Evite pata bordes laterales que pueden ser más sensibles. La respuesta esperada es una pataretirada, que retroceden repentina o lamiendo la pata. Considere la respuesta como positiva si se observan al menos tres respuestas esperadas de los cinco ensayos. Una pata dada está siempre a prueba tres veces, pero la cuarta y quinta se realizan los ensayos sólo si 1 o 2 respuesta (s) fue (fueron) observada durante las tres primeras pruebas. En ratones C57BL/6J, comenzar las pruebas antes de la cirugía con la 1,4 g filamento. Después de la cirugía, comenzará las pruebas con el 0,4 g filamento. Si se observa una respuesta positiva con el filamento primera prueba, probar un filamento de fuerza menor (en lugar de más) en el paso 4.3.2. </li><li> Aplicar el mismo filamento para los próximos animales de acuerdo con el procedimiento 4.3.1. Una vez que todos los animales se ponen a prueba, empezar de nuevo en el primer animal con el siguiente filamento de fuerza mayor. Repita el procedimiento hasta que todos los ratones dan una respuesta positiva. Notas: Prueba de cada animal hasta dos filamentos consecutivos dan una respuesta positiva. Considere el valor gramo del filamento de un menor que dio una respuesta positiva como el ingenio de la pataumbral hdrawal para este animal. </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El modelo de &quot;manguito&quot; fue desarrollado inicialmente en ratas para obtener una lesión de constricción crónica estandarizada y reproducible con la implantación de múltiples puños de todo el nervio ciático 6. Luego fue modificado para implantar un solo manguito 7,8, a pesar de que algunos grupos de investigación todavía utilizan la inserción del manguito múltiple 19-22. Luego fue adaptado a los ratones 9,23, lo que abrió la posibilidad de utilizar animales transgénicos. El manguito es generalmente de 2 mm de largo, pero otras longitudes también se han utilizado en ratas 22. El tubo de polietileno depende de la especie: PE-20 en ratones 9, y PE-60 24,25 o PE-90 7,8,26,27 en ratas. La alodinia mecánica se mide con pelos de von Frey. En esta prueba, los valores absolutos para los umbrales de retirada de la pata puede depender de la superficie sobre la que el animal se encuentra 28 o de la duración del filamento de flexión 3, pero estos factores no hacerafectar a la detección de la alodinia neuropática. El modelo de &quot;manguito&quot; es de interés para el estudio de los mecanismos de dolor neuropático. Fue utilizado para estudiar los cambios morfológicos en las fibras mielínicas y amielínicas 6,29, y los cambios funcionales en las neuronas sensoriales, las fibras aferentes primarias y las neuronas espinales 19,21,22,30-35. Se permitió demostración de que la activación glial y un cambio central en gradiente de aniones neuronal participan en los cambios en la actividad y en las respuestas de las neuronas nociceptivas espinales y en la alodinia neuropática 24,36-38. La influencia de los receptores de glutamato 7,39-41, de receptores opioides 16,42-45 y de los receptores nicotínicos 46 se estudió también en este modelo. Otro interés del modelo es su respuesta a los tratamientos actuales de dolor neuropático, es decir., Gabapentinoides y antidepresivos. Similares a las observaciones clínicas: gabapentinoides muestran tanto unan efecto analgésico de corta duración aguda a altas dosis y una acción sostenida para aliviar el retraso que se observa después de unos días de tratamiento, los antidepresivos tricíclicos y de serotonina y noradrenalina inhibidores no tienen efecto analgésico agudo en dosis de referencia, sino que muestran un retraso en el alivio sostenido acción que requiere de 1 a 2 semanas de tratamiento, y el inhibidor de la recaptación de serotonina fluoxetina es eficaz 16. El modelo es, pues, apropiado para estudiar el mecanismo molecular que subyace a estos tratamientos 16-18,44,45,47, el cual puede revelar nuevas dianas terapéuticas para probar en pacientes 48-51. Por último, el modelo también permite el estudio de las consecuencias anxiodepressive de dolor neuropático. Clínicamente, estas consecuencias afectan a alrededor de un tercio de los pacientes con dolor neuropático, pero se preclínicamente menos estudiados que los aspectos sensoriales del dolor. En este modelo, un desarrollo dependiente del tiempo de la ansiedad-como y depresiónfenotipos-vos como está presente el 52 y el mecanismo relacionado tanto, se pueden abordar. Los puños y procedimientos estandarizados en este modelo de ratón del dolor neuropático como resultado una baja variabilidad interindividual de la alodinia mecánica. La posibilidad de utilizar animales modificados genéticamente 17,18,44-47,52, la alodinia de larga duración, la respuesta a los tratamientos utilizados clínicamente y el desarrollo dependiente del tiempo de los síntomas anxiodepressive hacen de este modelo apropiado para el estudio de los diversos aspectos y consecuencias de dolor neuropático y sus tratamientos, que ya se han llevado a valiosa información a este campo de investigación.

El dolor neuropático es generalmente crónica y surge como consecuencia de una lesión o una enfermedad que afecta el sistema somatosensorial. Cambios de mala adaptación en las neuronas sensoriales lesionados y a lo largo de toda la vía nociceptivo dentro del sistema nervioso central participan en este complejo síndrome. Varios modelos han sido desarrollados en los roedores para estudiar el dolor neuropático y sus tratamientos 1-3. En base a etiologías conocidas, los modelos de dolor neuropático objetivo en la imitación de la polineuropatía observado en la diabetes, las lesiones a los nervios periféricos, las lesiones centrales, la neuralgia del trigémino, las neuropatías consecutivos a la quimioterapia, la neuralgia post-herpética, etc Diferentes modelos de lesión del nervio periférico en los roedores se centran en el nervio ciático. Estos modelos dependen de una compresión y / o una sección de este nervio. De hecho, el nervio ciático ofrece cirugía relativa fácil y permite pruebas basadas en reflejos de retirada de la pata. El models de la compresión del nervio crónica incluyen, por ejemplo: la lesión crónica de constricción (CCI) de 4,5, el nervio ciático esposar 6-9, la ligadura parcial del nervio ciático (PSL) 10, la ligadura del nervio espinal (SNL) 11, o el común ligadura del nervio peroneo 12. Modelos que se refiere como &quot;la lesión del nervio escatimado&quot; (SNI) también se utilizan ampliamente. Se componen de una ligadura apretada y axotomía de dos de las tres ramas terminales del nervio ciático, mientras que la tercera rama se mantiene intacta 13-15. Los diversos modelos de dolor neuropático, que se dirigen el nervio ciático, dan como resultado una alodinia mecánica crónica (una respuesta nociceptiva a un estímulo normalmente no-nociceptivo) en la pata trasera lesionada. Aquí, se describe el procedimiento de cirugía detallada para el &quot;modelo de manguito&quot; de dolor neuropático en ratones. Consiste en la implantación de un manguito de polietileno alrededor de la rama principal del nervio ciático 6-9. ThTambién se describe e uso de filamentos de von Frey. Estos filamentos permiten la evaluación de la alodinia mecánica que es un síntoma nociceptivo de larga duración presente en este modelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:188px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-20 polyethylene tubing</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PY2-59-8323</td>
			<td>Splitted before surgery</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Centravet</td>
			<td>IMA004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251</td>
			<td>Freshly prepared before surgery</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ocry-gel</td>
			<td>Centravet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plier</td>
			<td>FST</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>52.5 mm straight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bulldog clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>p130 18038-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perforated plate</td>
			<td>CTTM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">von Frey filaments</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>NC-12775</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the sciatic nerve cuffing model of neuropathic pain in mice

El dolor neuropático surge como consecuencia de una lesión o una enfermedad que afecta el sistema somatosensorial. Este síndrome resulta de los cambios de mala adaptación en las neuronas sensoriales lesionados y a lo largo de toda la vía nociceptivo dentro del sistema nervioso central. Por lo general es crónica y difícil de tratar. Con el fin de estudiar el dolor neuropático y sus tratamientos, diferentes modelos se han desarrollado en los roedores. Estos modelos se derivan de causas conocidas, reproduciendo así las lesiones de nervios periféricos, lesiones centrales y metabólicas, neuropatías infecciosas-, o relacionados con la quimioterapia. Los modelos murinos de lesión del nervio periférico a menudo se dirigen el nervio ciático, que es de fácil acceso y permite pruebas nociceptivas en la pata trasera. Estos modelos se basan en una compresión y / o una sección. Aquí, se describe el procedimiento de cirugía detallada para el &quot;modelo de manguito&quot; de dolor neuropático en ratones. En este modelo, un manguito de tubo de polietileno PE-20 de longitud estandarizada (2 mm) es de forma unilateral implanted alrededor de la rama principal del nervio ciático. Se induce una alodinia mecánica de larga duración, es decir., Una respuesta a un estímulo nociceptivo normalmente no nociceptivo que se puede evaluar mediante el uso de filamentos de von Frey. Además de los procedimientos de cirugía y pruebas detalladas, también se discute el interés de este modelo para el estudio del mecanismo del dolor neuropático, para el estudio del dolor neuropático aspectos sensoriales y anxiodepressive, y para el estudio de tratamientos para el dolor neuropático.

Los datos se expresan como media ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron mediante análisis multifactorial de la varianza (ANOVA) o unpaired t-pruebas, de acuerdo con el diseño experimental. Para estos análisis, los grupos de cirugía simulada y el manguito, así como la solución salina vs tratamientos farmacológicos fueron considerados como entre los grupos factores. Cuando sea apropiado, se utilizaron los análisis de medidas repetidas de los datos del curso del tiempo. Las comparaciones post hoc se realizaron mediante la prueba de Duncan. Significación estadística se consideró en p &lt;0,05. Al usar los procedimientos que se describen más arriba, los resultados del manguito de implantación en un alodinia ipsolateral como se ilustra en la Figura 1. Una vez que el ratón está habituado a el procedimiento de prueba, los valores para los umbrales de retirada de la pata en la prueba de von Frey se mantienen estables en el tiempo y son no se ve afectado por el procedimiento quirúrgico de por sí, como se ilustra en animales Sham. Sin embargo, debería serobservó que una alodinia post-quirúrgica transitoria generalmente se puede observar en ratones Sham. Cuando tales alodinia está presente, la respuesta de retirada de la pata vuelve a la línea de base después de un par de días después de la cirugía. En ratones Gemelos, la alodinia ipsilateral ya está presente en el primero día después de la cirugía y se mantiene durante más de 2 meses (ver 9, y en la Figura 1; F8, 344 = 29,5, p &lt;0,001). La alodinia inducida manguito permanece ipsilateral en ratones C57BL/6J cuando se mide por la prueba de von Frey como se describió anteriormente, pero en otras condiciones la presencia de alodinia en la pata contralateral también se puede observar 8. Los valores absolutos para la línea de base son por lo general entre 4 y 6 g en ratones C57BL/6J, pero el protocolo de prueba pueden afectar estos valores. Los antidepresivos tricíclicos son algunos de los tratamientos de primera línea para el dolor neuropático clínicos. En este modelo, la nortriptilina fármaco antidepresivo tricíclico (5 mg / kg, intraperitoneal, dos veces al día) relieves la alodinia neuropático después de alrededor de 2 semanas de tratamiento, como se ilustra en la Figura 2 (F7, 91 = 15,3, p &lt;0,001; post-hoc de: (CuffNor = Sham)&gt; CuffSal a p &lt;0,001 en los días 29 a 34). A esta dosis, no se observa ninguna acción analgésica aguda de la antidepresivos 16,17. Para imitar el alivio del dolor duradera que está presente en los pacientes que toman estos fármacos, los ratones pueden ser probados antes de la administración del fármaco por la mañana en lugar de después. Tal procedimiento permite la evaluación de un efecto de larga duración preparado por días anteriores de tratamiento. En este caso, se requiere de 1 a 2 semanas de tratamiento para observar un alivio duradero de la alodinia neuropática. Cuando se interrumpe el tratamiento, una recaída se observa por lo general dentro de 3 a 4 días 18. Al lado de algunos antidepresivos, gabapentinoides son los otros tratamientos de primera elección para el dolor neuropático. La gabapentina tiene una acción analgésica aguda y transitoria en este modelo 16, pero también se muestra un retraso y lon<html> g duración al probar el animal cada día antes de la administración del fármaco (Figura 3, p &lt;0.001) acciones antialodínico. Esta acción es más rápida que con los fármacos antidepresivos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51608/51608fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51608/51608fig1.jpg" /> Figura 1. Mecánica umbrales de retirada de la pata en el modelo de manguito de dolor neuropático en ratones. Ratones C57BL/6J machos adultos fueron habituados al procedimiento de von Frey hasta que se obtuvo una línea de base estable (la línea de base se representa en el punto 0 en el gráfico). Ambas patas fueron probados. Los ratones Gemelos muestran alodinia mecánica ipsilateral como se muestra por los umbrales de retirada de la pata en posición baja (n = 10 por grupo). tp_upload/51608/51608fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Acción retardada antialodínico de un antidepresivo tricíclico. Después de dos semanas después de la cirugía, los ratones recibieron tratamiento intraperitoneal dos veces al día (mañana y noche), ya sea con NaCl al 0,9% o 5 mg / kg de clorhidrato de nortriptilina (n = 5 o 6 por grupo ). La prueba de von Frey se realizó antes de que el tratamiento de la mañana. Con este procedimiento, se observó una acción retardada antialodínico de la nortriptilina, que requiere alrededor de 12 días de tratamiento. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51608/51608fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51608/51608fig3.jpg" /> Figura 3. Antialodínico acción de un gabapentinoid. Después de tres semanas después de la cirugía, los ratones recibieron tratamiento intraperitoneal dos veces al día (mañana y noche), ya sea con 0,9% de NaCl o 10 mg / kg de gabapentina (n = 5 por grupo). La prueba de von Frey se hizo antes de que el tratamiento de la mañanaMent. Con este procedimiento, se observó una acción retardada antialodínico y duradera de la gabapentina. Los datos se presentan antes de comenzar los tratamientos y en el sexto día de los tratamientos.

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The Sciatic Nerve Cuffing Model of Neuropathic Pain in Mice

El dolor neuropático es una consecuencia de una lesión o enfermedad que afecta al sistema somatosensorial. El &quot;modelo de puño&quot; del dolor neuropático en ratones consiste en la implantación de un manguito de polietileno alrededor de la rama principal del nervio ciático. La alodinia mecánica se prueba utilizando filamentos de von Frey.

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