Name: combined in vivo optical and &#181;ct imaging to monitor infection, inflammation, and bone anatomy in an orthopaedic implant infection in mice
Uploaded: 2014-10-16T13:00:00
Duration: 18 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined In vivo Optical and Ã‚ÂµCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una Surgical Resident Research Scholars Program H &amp; H Lee (a gennaio), un AO Foundation Start-Up concessione S-12-03M (a LSM) e un National Institutes of Health sovvenzione R01-AI078910 (a LSM) .

<ol>
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JAM, BNT, EL, NZ, KPF sono pagati i dipendenti di PerkinElmer, che produce gli strumenti di imaging, a condizione che il Xen29 bioluminescente S. ceppo aureus, e pagato per le spese di pubblicazione di questo video-articolo. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Multimodalità di imaging come ad esempio tecniche di imaging che utilizzano in vivo imaging ottico in combinazione con l&#39;imaging μCT fornisce un nuovo approccio tecnologico che permette la visualizzazione 3D, la quantificazione e il monitoraggio longitudinale dei processi biologici in un contesto anatomico 1-4. I protocolli di questo studio forniscono informazioni dettagliate su come in vivo bioluminescenti e di imaging fluorescente può essere combinato con l&#39;imaging μCT in un impianto protesico ortopedico modello di infezione nei topi per monitorare la carica batterica, infiammazione neutrofila e cambiamenti anatomici nel midollo non invasivo e longitudinalmente su tempo. Nel loro insieme, le informazioni ottenute dalla combinazione di imaging ottico e strutturale rappresenta un importante progresso tecnologico, che può essere particolarmente adatto per lo studio dei processi biologici e patologici che colpiscono il sistema muscolo-scheletrico. Un interesseconstatazione zione che deve essere sottolineato è che abbiamo osservato che i segnali fluorescenti EGFP-neutrofili scendono a livelli di fondo da 14-21 giorni e sono rimasti a livelli di fondo per tutta la durata dell&#39;esperimento, nonostante la presenza di batteri bioluminescenti. E &#39;improbabile che l&#39;irradiazione di raggi X influenzato la sopravvivenza dei neutrofili, come abbiamo osservato cinetiche simili dei segnali neutrofili nei topi non irradiati 19. Nel nostro precedente lavoro che coinvolge un modello di S. ferite infette aureus, infiltrazione di neutrofili coinvolto una combinazione di robusta reclutamento dei neutrofili dalla circolazione, la sopravvivenza dei neutrofili prolungato nel sito di infezione e l&#39;homing delle cellule progenitrici + KIT per l&#39;ascesso, dove localmente danno luogo a maturare neutrofili 23. E &#39;probabile che processi simili hanno contribuito a infiltrazione di neutrofili nel impianto ortopedico S. modello di infezione aureus. Anche se non si sa il motivo per cui i segnali neutrofili diminuiti nel Orthopmodello di infezione aedic, potrebbe essere che la risposta immunitaria è cambiato nel corso del tempo come questa infezione progredito da una acuta infezione cronica, e questo è un argomento di indagine futura. Ci sono limitazioni con questo modello murino di infezione protesi articolare ortopedica e la multimodalità di imaging in vivo che dovrebbe essere notato. In primo luogo, questo modello di topo è una semplificazione delle procedure reali e materiali utilizzati in chirurgia ortopedica negli esseri umani 24. Tuttavia, questo modello fa ricapitolare l&#39;infezione cronica e conseguente infiammazione nel tessuto osseo e articolare che si vede nelle infezioni umane impianti ortopedici 8,9. In aggiunta, per ottenere le immagini μCT, relativamente basse dosi di raggi X irradiazione sono stati usati per ridurre al minimo eventuali effetti negativi sulla salute degli animali durante il corso dell&#39;infezione. Per una migliore risoluzione delle ossa, dosi più elevate di radiazioni a raggi X potrebbero essere utilizzati per l&#39;imaging μCT su eutanasia unnimals. Tuttavia, questo eliminerebbe la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente i cambiamenti ossei per la durata degli esperimenti. In conclusione, l&#39;imaging multimodale che coinvolge l&#39;intera combinazione di imaging ottico animali in vivo con l&#39;imaging anatomico μCT ha permesso di informazioni più complete sulla infezione e risposta infiammatoria. Inoltre, queste tecniche hanno permesso la valutazione delle conseguenze della infezione e infiammazione nel tessuto osseo e delle articolazioni. I lavori futuri potrebbe approfittare di imaging multimodale per valutare l&#39;efficacia delle terapie antimicrobiche, le risposte immunitarie, patogenesi della malattia e dei cambiamenti reattivi nelle ossa, come abbiamo iniziato a indagare 14-18. Inoltre, l&#39;imaging multimodale potrebbe valutare sonde e rivelatori per diagnosticare la presenza di un&#39;infezione come precedentemente descritto in modelli animali di infezione coscia, endocardite, infettano polmonareioni e infezioni biomateriale 25-28. Infine, l&#39;uso di immagini multimodalità potrebbe essere esteso al di là di malattie infettive e utilizzato attraverso le discipline, tra cui ortopedia, reumatologia e oncologia, di indagare altre condizioni che l&#39;impatto del sistema muscolo-scheletrico, come il cancro scheletrico, malattia metastatica, fratture e artrite 5-7 .

Multimodalità tecniche di imaging preclinico che prevedono la combinazione di informazioni ottiche e anatomiche consentono la visualizzazione e il monitoraggio dei fenomeni biologici in 3D 1-4. Dal momento che l&#39;imaging μCT permette la visualizzazione squisita dell&#39;anatomia ossea, utilizzando immagini μCT in concomitanza di con imaging ottico rappresenta una combinazione unica che potrebbe essere particolarmente utile per i processi che coinvolgono l&#39;osso biologia 5-7 indagando. Un esempio potrebbe essere quello di utilizzare queste tecniche per studiare le infezioni impianti ortopedici, che rappresentano una complicazione disastroso seguito di interventi chirurgici ortopedici 8,9. Batteri biofilm si formano sugli oggetti estranei impiantati che promuovono la sopravvivenza dei batteri fungendo da barriera fisica che impedisce alle cellule immunitarie di rilevamento delle infezioni e blocca gli antibiotici di accedere ai batteri 10,11. L&#39;infezione cronica e persistente del tessuto articolare (artrite settica) und dell&#39;osso (osteomielite) induce il riassorbimento osseo che porta ad un allentamento della protesi ed eventuale guasto 8,9. Questo risultato osteolisi periprotesica è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità 12,13. Nel nostro lavoro precedente, bioluminescenti in vivo e di imaging fluorescente è stato utilizzato insieme con i raggi X e micro-tomografia computerizzata di immagini (μCT) in un modello di infezione protesica articolare ortopedica nei topi 14-19. Questo modello ha coinvolto ponendo un titanio fili di Kirschner (filo K) in modo tale che l&#39;estremità tagliata dell&#39;impianto esteso nel ginocchio dai femori di topi 14-19. Un inoculo di Staphylococcus aureus (ceppo bioluminescente Xen29 o Xen36) è stato poi pipettati sulla superficie dell&#39;impianto in ginocchio prima che il sito chirurgico è stato chiuso 14-19. In vivo imaging ottico è stato utilizzato per rilevare e quantificare i segnali bioluminescenti, che corrispondeva alla number dei batteri nel tessuto infetto articolazioni e delle ossa 14-19. Inoltre, in vivo imaging di fluorescenza di topi LysEGFP, che possiedono neutrofili fluorescenti 20, è stato utilizzato per quantificare il numero di neutrofili che emigrarono per le articolazioni del ginocchio infette contenenti gli impianti K-wire 14,19. Infine, le modalità di imaging anatomiche, tra cui imaging ad alta risoluzione a raggi X e l&#39;imaging μCT, consentiti rispettivi 2D e 3D di immagini anatomiche dell&#39;osso colpito tutta la durata di infezione cronica, che avremmo arbitrariamente finire tipicamente tra 2 e 6 settimane postoperatorie 16 , 18. Utilizzando questo modello, l&#39;efficacia della terapia antimicrobica locale e sistemica, le risposte immunitarie protettive e alterazioni anatomiche patologiche in osso potrebbe essere valutata 14-18. In questo manoscritto, i protocolli dettagliati per le modalità di imaging ottico e μCT in questo ortopedica protesica modello di infezione articolare sono stati forniti da representatiSistema di studiare processi biologici nel contesto anatomico dell&#39;osso ve. Questi includono le procedure chirurgiche per modellare un ortopedico infezione protesi articolare nei topi, 2D e 3D in procedure di imaging ottico in vivo (per rilevare i segnali bioluminescenti batteriche e segnali neutrofili fluorescenti), μCT acquisizione di imaging e di analisi e co-registrazione di immagini ottiche 3D con il immagini μCT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Soy Agar</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysEGFP knockin mouse strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Products, Stamford, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter)</td>
			<td>Synthes, West Chester, PA</td>
			<td>492.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cutter - Duracut T.C.</td>
			<td>H&#38;H Company, Ontario, Canada</td>
			<td>83-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL</td>
			<td>118718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting)</td>
			<td>Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International.</td>
			<td>95056-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml)</td>
			<td>Zoopharm, Windsor, CO</td>
			<td></td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/IVISSPE?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS Spectrum Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>optical in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Quantum%20FX%20%20microCT?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Quantum FX in vivo &#956;CT system</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>&#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS SpectrumCT Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>combined optical and &#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/119240?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Living Image Software</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software for in vivo optical imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo optical and &#181;ct imaging to monitor infection, inflammation, and bone anatomy in an orthopaedic implant infection in mice

L&#39;imaging multimodale è emerso come un approccio tecnologico comune utilizzato sia nella ricerca preclinica e clinica. Tecniche avanzate che combinano in vivo imaging ottico e μCT consentono la visualizzazione di fenomeni biologici in un contesto anatomico. Queste modalità di imaging possono essere particolarmente utile per studiare le condizioni che l&#39;osso impatto. In particolare, le infezioni impianti ortopedici sono un importante problema clinico in chirurgia ortopedica. Queste infezioni sono difficili da trattare perché biofilm batterici si formano sui materiali impiantati chirurgicamente stranieri, con conseguente infiammazione persistente, osteomielite ed eventuale osteolisi dell&#39;osso che circonda l&#39;impianto, che si traduce in ultima analisi in impianto allentamento e fallimento. Qui, un modello murino di un impianto protesico ortopedico infetto è stato utilizzato che ha coinvolto il posizionamento chirurgico di un impianto con fili di Kirschner in un canale endomidollare del femore in modo tale che l&#39;estremità dell&#39;impianto eXtended nell&#39;articolazione del ginocchio. In questo modello, i topi LysEGFP, un ceppo di topi che ha neutrofili EGFP-fluorescenti, sono stati impiegati in combinazione con un bioluminescente ceppo Staphylococcus aureus, che emette luce naturale. I batteri sono stati inoculati nelle articolazioni del ginocchio dei topi prima di chiudere il sito chirurgico. In vivo bioluminescenti e di imaging fluorescente è stato utilizzato per quantificare la carica batterica e la risposta infiammatoria dei neutrofili, rispettivamente. Inoltre, l&#39;imaging μCT è stata eseguita sulla stessa topi in modo che la posizione 3D del bioluminescente e segnali ottici fluorescenti potrebbe essere co-registrate con le immagini μCT anatomiche. Per quantificare i cambiamenti nel tessuto osseo nel corso del tempo, il volume esterno delle ossa dei femori distali sono stati misurati in punti temporali specifici utilizzando un processo di segmentazione contorno a base semi-automatico. Nel loro insieme, la combinazione di immagini in vivo bioluminescenti / fluorescente con immagini μCT può essere particolarmente utile fo il monitoraggio non invasivo della infezione, risposta infiammatoria e cambiamenti anatomici in osso nel tempo.

In bioluminescenti vivo e di imaging fluorescente Nel presente studio, il protocollo è descritto per questo modello precedentemente pubblicata di un&#39;infezione protesi articolare ortopedica in topi 14-19, che comporta il posizionamento chirurgico di un impianto in titanio K-filo che si estende da un canale endomidollare nel femore nel giunto spazio di 14-19. S. aureus ceppo bioluminescente Xen29 (1 x 10 3 CFU in 2 ml PBS) è stato dispensato direttamente sulla parte superiore del titanio dell&#39;impianto fine del ginocchio prima di chiudere il sito chirurgico 16. Per visualizzare e quantificare il carico batterico e neutrofili afflusso non invasiva in topi anestetizzati LysEGFP, tutta imaging ottico animali in vivo è stata eseguita in sequenza di immagini i segnali bioluminescenti dai batteri e segnali EGFP fluorescenza dei neutrofili infiltranti utilizzando l&#39;intero animale ottica IVIS Spectrum in vivosistema di imaging in tre giorni postoperatori (ad esempio, giorni 2, 14 e 28). I segnali bioluminescenti di topi Xen29-infettati sono rimasti al di sopra dei segnali di topi sham-infettati per tutta la durata dell&#39;esperimento (Figura 1A, C), 16 di fondo. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che i segnali in vivo bioluminescenti strettamente approssimato del numero di ex vivo CFU isolati dal / tessuto osseo articolare e aderente agli impianti 17,18. Inoltre, i segnali EGFP fluorescenti erano più alti rispetto ai topi sham-infettati in momenti iniziali, ma si avvicinarono i livelli di fondo nel corso di infezione (Figura 2B, C) ​​16. 3D co-registrazione di segnali ottici in vivo con immagini μCT Per visualizzare i segnali ottici (segnali cioè, bioluminescenti batterica e EGFP fluorescenti) nel contesto anatomico delle articolazioni post-chirurgica del ginocchio in 3D, le immagini ottiche generate utilizzando il sistema di imaging IVIS Spectrum sono stati co-registrate con le immagini μCT generati utilizzando il sistema di imaging Quantum FX μCT. Questa co-registrazione potrebbe essere realizzato perché la camera di imaging del mouse può essere inserito o macchina per verificare che i topi erano nella stessa esatta orientazione. Per verificare questa precisione, i risultati sono stati confrontati con l&#39;acquisizione di un&#39;immagine eseguita usando l&#39;Spectrum CT-in vivo IVIS sistema di imaging che integra sia le modalità in un unico strumento senza richiedere trasferimento fisico dell&#39;animale. Per mappare i dati ottici sulle immagini μCT in 3D, abbiamo utilizzato una tomografia ottica algoritmo di ricostruzione diffusa 16. La ricostruzione 3D risultante è mostrato (filmato 1). Inoltre, l&#39;imaging μCT permesso la visualizzazione e la quantificazione dei cambiamenti conseguenti nella qualità e le dimensioni delle ossa che si sono verificati durantel&#39;infezione (Figura 2) 16. Come precedentemente riferito, il volume esterno osso del femore distale sostanzialmente aumentata nel tempo (Figura 2A) 16. Per quantificare queste modifiche, analisi di immagini 3D volumetrica è stata eseguita sulla distale 25% della superficie ossea del femore e le variazioni del volume osseo nel tempo sono stati normalizzati per il volume osseo iniziale. Il volume osseo esterno sostanzialmente aumentato nei topi infetti rispetto ai topi sham-infetti (Figura 2b) 16. L&#39;aumento del volume del femore distale esterno era probabilmente dovuta a un danno osseo causata da infezione del tessuto osseo e articolare, che sono stati osservati usando μCT di imaging e di analisi istologica 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 2D in vivo </strong&gt; bioluminescenti e segnali fluorescenti. S. aureus Xen29 o senza batteri (non infetti) sono stati inoculati in ginocchio dopo il posizionamento K-filo e topi LysEGFP sono stati ripresi utilizzando il sistema di imaging IVIS Spectrum 16. (A) Media in vivo segnali bioluminescenti misurata in termini di flusso totale (fotoni / sec) ± sem. (B) media in vivo EGFP segnali fluorescenti misurata in totale efficienza luminosa (fotoni / sec) / (W / cm 2) ± sem. (C) Rappresentante in bioluminescenti vivo e segnali fluorescenti sovrapposti su una fotografia in bianco e nero immagine dei topi. Il limite di rivelazione della carica batterica utilizzando imaging in vivo bioluminescente è compreso tra 1 e 2 x 10 1 x 10 3 CFU. * P &lt;0.05, † p &lt;0.01, ‡ p &lt;0,001 Xen29 topi infettati contro topi sham-infettati (t-test di Student [a due code]). Si prega dinotare che questo è una figura rappresentativa che comprende dati precedentemente pubblicati generati utilizzando Xen29 e ripreso con il sistema di imaging IVIS Lumina XR 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 3D μCT di imaging. S. aureus Xen29 o senza batteri (non infetti) sono stati inoculati in ginocchio dopo il posizionamento K-filo e topi sono stati ripresi utilizzando il Quantum FX in vivo del sistema μCT. (A) Rappresentante 3D rendering di μCT Xen29 topi -infected (pannelli superiori) e sham-infettati topi (pannelli inferiori). (B) Percentuale di variazione volume osseo esterno (distale il 25% dei femori) normalizzati al ti inizialeme punto (media ± SEM). * P &lt;0.05, † p &lt;0.01, ‡ p &lt;0,001 Xen29 topi infettati contro topi sham-infettati (t-test di Student [a due code]). Si prega di notare che questa è una figura rappresentativa che comprende dati precedentemente pubblicati generati utilizzando il ceppo bioluminescente S. aureus Xen29 e ripreso con la FX in vivo μCT sistema di imaging Quantum 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/Movie_1.mpg" target="_blank">Movie 1</a> . Rappresentante 3D anatomica co-registrazione dei segnali bioluminescenti Xen29 ei segnali fluorescenti EGFP-neutrofili in combinazione con le immagini μCT. Le immagini vengono ruotate sull&#39;asse verticale.

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Combined In vivo Optical and Ãƒâ€šÃ‚ÂµCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combinato imaging ottico e μCT in un modello murino di infezione impianto ortopedico, utilizzando un ceppo ingegnerizzato bioluminescente di Staphylococcus aureus, purché la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente la dinamica della infezione batterica, così come la risposta infiammatoria corrispondente e cambiamenti anatomici nel osso.

Combinato<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT Imaging Monitor per infezione, infiammazione, e Bone Anatomy in una infezione ortopedica impianto in topi

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

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