Name: combined in vivo optical and &#181;ct imaging to monitor infection, inflammation, and bone anatomy in an orthopaedic implant infection in mice
Uploaded: 2014-10-16T13:00:00
Duration: 18 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined In vivo Optical and Ã‚ÂµCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por un programa de H &amp; H Lee Investigación Residente Quirúrgico Eruditos (a JAN), una Fundación AO Start-Up subvención S-12-03M (a LSM) y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01-AI078910 (a LSM) .

<ol>
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JAM, BNT, EL, NZ, KPF se pagan los empleados de PerkinElmer, que fabrica los instrumentos de imagen, siempre que el Xen29 bioluminiscente S. aureus cepa, y pagó por los gastos de publicación de este video-artículo. El resto de los autores no tienen nada que revelar.

La multimodalidad de imágenes tales como las técnicas de imagen que utilizan en imágenes ópticas vivo en conjunción con las imágenes μCT proporciona un nuevo enfoque tecnológico que permite la visualización 3D, la cuantificación y el seguimiento longitudinal de los procesos biológicos en un contexto anatómico 1-4. Los protocolos en el presente estudio proporcionan información detallada de cómo in vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes pueden ser combinadas con imágenes μCT en un modelo de infección ortopédica protésica del implante en ratones para monitorizar la carga bacteriana, inflamación neutrofílica y cambios anatómicos en el hueso de forma no invasiva y longitudinalmente más tiempo. En su conjunto, la información obtenida mediante la combinación de imágenes ópticas y estructural representa un importante avance tecnológico, que puede ser especialmente adecuado para estudiar los procesos biológicos y las condiciones patológicas que afectan al sistema músculo-esquelético. Un interéshallazgo ción que debe señalarse es que se observó que las señales fluorescentes-EGFP neutrófilos disminuyó a los niveles de fondo por 14 a 21 días y se mantuvo en los niveles de base para la duración del experimento a pesar de la presencia de bacterias bioluminiscentes. Es poco probable que la irradiación de rayos X afectado la supervivencia de neutrófilos como se observó una cinética similar de las señales de neutrófilos en ratones no irradiados 19. En nuestro trabajo anterior que implica un modelo de S. heridas infectadas aureus, la infiltración de neutrófilos participan una combinación robusta de reclutamiento de neutrófilos de la circulación, la supervivencia prolongada de los neutrófilos en el sitio de infección y el homing de las células progenitoras KIT + para el absceso, donde localmente dan lugar a madurar neutrófilos 23. Es probable que los procesos similares contribuyeron a la infiltración de neutrófilos en el implante ortopédico S. modelo de infección aureus. Aunque se desconoce por qué las señales de neutrófilos disminuyó en el orthopmodelo de infección aédico, podría ser que la respuesta inmune cambió con el tiempo como esta infección progresó de una infección aguda a crónica y este es un tema de investigación futura. Existen limitaciones con este modelo de ratón de infección articular protésica ortopédica y el vivo de imágenes multimodalidad en que debe señalarse. En primer lugar, este modelo de ratón es una simplificación de los procedimientos reales y los materiales utilizados en cirugía ortopédica en seres humanos 24. Sin embargo, este modelo hace recapitular la infección crónica y la inflamación resultante en el hueso y tejido de las articulaciones que se ve en las infecciones de implantes ortopédicos humanos 8,9. Además, para obtener las imágenes μCT, se utilizaron dosis relativamente bajas de irradiación de rayos X para minimizar los efectos adversos sobre la salud de los animales durante el curso de la infección. Para mejorar la resolución de hueso, dosis más altas de radiación de rayos X podría ser utilizado para obtener imágenes de μCT en un sacrificadosnimals. Sin embargo, esto eliminaría la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente los cambios en el hueso largo de la duración de los experimentos. En conclusión, las imágenes multimodalidad que implica la combinación de imágenes ópticas animal completamente en vivo con imágenes μCT anatómica ha permitido obtener información más completa sobre la infección y la respuesta inflamatoria. Además, estas técnicas han permitido la evaluación de las consecuencias de la infección y la inflamación en el hueso y tejido de las articulaciones. El trabajo futuro podría aprovecharse de formación de imágenes multimodalidad para evaluar la eficacia de las terapias antimicrobianas, las respuestas inmunes, la patogénesis de la enfermedad y los cambios reactivos en el hueso como hemos comenzado a investigar 14-18. Además, las imágenes multimodalidad podría evaluar sondas y marcadores para diagnosticar la presencia de una infección como se describió previamente en modelos animales de una infección del muslo, endocarditis, Infect pulmonariones y las infecciones de biomateriales 25-28. Por último, el uso de la proyección de imagen multimodalidad podría expandirse más allá de las enfermedades infecciosas y se utiliza en todas las disciplinas, incluyendo ortopedia, reumatología y oncología, para investigar otras condiciones que impactan el sistema músculo-esquelético, como el cáncer óseo, enfermedad metastásica, las fracturas y la artritis 5-7 .

Multimodalidad técnicas de imagen preclínica que implican la combinación de información óptica y anatómica permiten la visualización y monitoreo de los fenómenos biológicos en 3D 1-4. Desde μCT de imágenes permite la exquisita visualización de la anatomía del hueso, el uso de imágenes μCT en conjunción con de formación de imágenes ópticas representa una combinación única que podría ser especialmente útil para la investigación de procesos que involucran la biología ósea 5-7. Un ejemplo sería el uso de estas técnicas para estudiar infecciones de implantes ortopédicos, que representan una complicación desastrosa después de procedimientos quirúrgicos ortopédicos 8,9. Bacterias biopelículas se forman en los objetos extraños implantados que promueven la supervivencia de las bacterias al servir como una barrera física que evita que las células inmunes de la detección de la infección y bloquea el acceso a los antibióticos a las bacterias 10,11. La infección crónica y persistente del tejido de las articulaciones (artritis séptica) und hueso (osteomielitis) induce la resorción ósea que conduce al aflojamiento de la prótesis y 8,9 eventual falla. Esta osteolisis periprotésica resultante se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad 12,13. En nuestro trabajo anterior, se utilizó in vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes, junto con los rayos X y tomografía micro-computarizada (μCT) en un modelo de infección de la articulación protésica ortopédica en ratones 14-19. Este modelo implicó la colocación de un alambre de titanio Kirschner-(K-hilos) de una manera tal que el extremo cortado del implante extendida en la articulación de la rodilla de los fémures de ratones 14-19. A continuación, un inóculo de Staphylococcus aureus (cepa bioluminiscente Xen29 o Xen36) se pipeteó sobre la superficie del implante en la articulación de la rodilla antes de la zona quirúrgica se cerró 14-19. In vivo de imágenes ópticas se utilizó para detectar y cuantificar las señales bioluminiscentes, que correspondió a la number de bacterias en el tejido de las articulaciones y el hueso infectado 14-19. Además, in vivo de fluorescencia de imágenes de los ratones LysEGFP, que poseen los neutrófilos fluorescentes 20, se utilizó para cuantificar el número de neutrófilos que emigraron a las articulaciones de la rodilla infectadas que contienen los implantes K-alambre 14,19. Por último, las modalidades de imágenes anatómicas, incluyendo imágenes de alta resolución de rayos X e imágenes μCT, permite respectiva 2D y 3D la imagen anatómica del hueso afectado por toda la duración de la infección crónica, que nos arbitrariamente terminar normalmente entre 2 y 6 semanas postoperatorias 16 , 18. Utilizando este modelo, la eficacia de la terapia antimicrobiana local y sistémico, las respuestas inmunes protectoras y cambios anatómicos patológicos en el hueso podría evaluarse 14-18. En este manuscrito, los protocolos de detalle de las modalidades de imágenes ópticas y μCT en este modelo de infección articulación protésica ortopédica fueron proporcionados como Representatisistema para estudiar los procesos biológicos en el contexto anatómico del hueso ve. Estos incluyen los procedimientos quirúrgicos para modelar una infección articulación protésica ortopédica en ratones, 2D y 3D en los procedimientos de imagen óptica in vivo (para detectar señales bioluminiscentes bacterianas y señales fluorescentes neutrófilos), adquisición y análisis de imágenes μCT y co-registro de imágenes ópticas en 3D con la imágenes μCT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Soy Agar</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysEGFP knockin mouse strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Products, Stamford, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter)</td>
			<td>Synthes, West Chester, PA</td>
			<td>492.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cutter - Duracut T.C.</td>
			<td>H&#38;H Company, Ontario, Canada</td>
			<td>83-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL</td>
			<td>118718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting)</td>
			<td>Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International.</td>
			<td>95056-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml)</td>
			<td>Zoopharm, Windsor, CO</td>
			<td></td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/IVISSPE?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS Spectrum Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>optical in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Quantum%20FX%20%20microCT?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Quantum FX in vivo &#956;CT system</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>&#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS SpectrumCT Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>combined optical and &#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/119240?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Living Image Software</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software for in vivo optical imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo optical and &#181;ct imaging to monitor infection, inflammation, and bone anatomy in an orthopaedic implant infection in mice

Formación de imágenes multimodalidad ha surgido como un enfoque tecnológico común utilizado tanto en la investigación preclínica y clínica. Las técnicas avanzadas que combinan en imágenes ópticas y μCT vivo permiten la visualización de los fenómenos biológicos en un contexto anatómico. Estas técnicas de imagen pueden ser especialmente útiles para estudiar las condiciones que el hueso impacto. En particular, las infecciones de implantes ortopédicos son un problema importante en la cirugía ortopédica clínica. Estas infecciones son difíciles de tratar debido a las biopelículas bacterianas se forman en los materiales implantados quirúrgicamente extranjeras, lo que lleva a la inflamación persistente, la osteomielitis y la eventual osteolisis del hueso que rodea el implante, que finalmente resulta en el aflojamiento del implante y el fracaso. Aquí, se utilizó un modelo de ratón de un implante de prótesis ortopédica infectado que implicó la colocación quirúrgica de un implante de Kirschner hilos en un canal intramedular en el fémur de tal manera que el extremo del implante eXtended en la articulación de la rodilla. En este modelo, los ratones LysEGFP, una cepa de ratón que tiene los neutrófilos EGFP fluorescentes, fueron empleados en conjunción con un bioluminiscente cepa de Staphylococcus aureus, que emite luz natural. Las bacterias se inocularon en las articulaciones de las rodillas de los ratones antes de cerrar el sitio quirúrgico. In vivo bioluminiscente y fluorescente de formación de imágenes se utilizó para cuantificar la carga bacteriana y la respuesta inflamatoria de neutrófilos, respectivamente. Además, las imágenes μCT se realizó en los mismos ratones para que la ubicación 3D de las señales ópticas fluorescentes bioluminiscente y podría ser co-registrado con las imágenes anatómicas μCT. Para cuantificar los cambios en el hueso con el tiempo, el volumen de hueso exterior de los fémures distales se midió en puntos de tiempo específicos utilizando un proceso de segmentación basado contorno semi-automatizado. Tomados en conjunto, la combinación de formación de imágenes in vivo bioluminiscente / fluorescente con imágenes μCT puede ser especialmente útil fo la monitorización no invasiva de la infección, respuesta inflamatoria y los cambios anatómicos en el hueso a través del tiempo.

En bioluminiscente vivo e imágenes fluorescentes En el presente estudio, el protocolo se describe para este modelo publicado previamente de una infección conjunta de prótesis ortopédica en ratones 14-19, que implica la colocación quirúrgica de un implante de K-alambre de titanio que se extiende desde un canal intramedular en el fémur en la articulación espacio de 14 a 19. S. aureus cepa bioluminiscente Xen29 (1 x 10 3 UFC en 2 l de PBS) se pipeteó directamente en la parte superior del implante de titanio fin en la articulación de la rodilla antes de cerrar el sitio quirúrgico 16. Para visualizar y cuantificar la carga bacteriana y neutrófilos afluencia de forma no invasiva en ratones anestesiados LysEGFP, se realizó de imágenes ópticas animal completamente en vivo secuencialmente imagen las señales bioluminiscentes de las bacterias y las señales fluorescentes EGFP de los neutrófilos que infiltran utilizando el animal completamente óptica IVIS Spectrum en vivosistema de imágenes en tres días del postoperatorio (es decir, días 2, 14 y 28). Las señales bioluminiscentes de ratones infectados por Xen29 mantuvieron por encima de las señales de fondo de ratones sham-infectados durante la duración del experimento (Figura 1 A, C) 16. Nuestro trabajo anterior demostró que las señales bioluminiscentes in vivo aproximadas estrechamente el número de CFU ex vivo aislados del / tejido óseo conjunta y adherente a los implantes 17,18. Además, las señales fluorescentes EGFP fueron mayores que los ratones de simulacro infectadas en los puntos de tiempo tempranos, pero se acercaron a los niveles de fondo durante el curso de la infección (Figura 2B, C) ​​16. Co-registro 3D de las señales ópticas en vivo con imágenes μCT Para visualizar las señales ópticas (señales es decir, bioluminiscentes bacteriana y fluorescentes EGFP) en el contexto anatómica de las articulaciones de la rodilla post-quirúrgicas in 3D, las imágenes ópticas generadas utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum fueron co-registradas con imágenes μCT generados usando el sistema de imágenes de Quantum FX μCT. Esta co-registro podría lograrse porque la cámara de imágenes de ratón podría ser insertado en cualquiera de las máquinas para asegurar que los ratones estaban en la misma orientación exacta. Para verificar esta precisión, los resultados se compararon con una adquisición de imágenes realizado mediante el CT Spectrum-in vivo del sistema de formación de imágenes IVIS que integra ambas modalidades en un instrumento sin requerir reubicación física del animal. Para asignar los datos óptica sobre las imágenes μCT en 3D, se utilizó una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 16. La reconstrucción 3D resultante se muestra (Película 1). Además, las imágenes μCT permite la visualización y cuantificación de los consiguientes cambios en la calidad y dimensiones de los huesos que se produjo durantela infección (Figura 2) 16. Como se informó anteriormente, el volumen de hueso exterior del fémur distal aumentó considerablemente con el tiempo (Figura 2A) 16. Para cuantificar estos cambios, se realizó análisis de imagen volumétrica 3D en el distal 25% de la superficie ósea de fémur y los cambios en el volumen de hueso con el tiempo se normalizaron al volumen inicial del hueso. El volumen de hueso exterior aumentó considerablemente en los ratones infectados en comparación con ratones infectados de manera simulada (Figura 2B) 16. El aumento en el volumen de hueso fémur distal exterior era probablemente debido a daño óseo causada por la infección del tejido y el hueso articular, que se observaron utilizando μCT de formación de imágenes y el análisis histológico 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. 2D in vivo </strong&gt; señales fluorescentes y bioluminiscentes. S. aureus Xen29 o no bacterias (no infectados) se inocularon en la articulación de la rodilla después de la colocación de Kirschner y ratones LysEGFP fueron imágenes utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum 16. (A) Media in vivo señales bioluminiscentes medida por flujo total (fotones / seg) ± sem. (B) La media in vivo EGFP señales fluorescentes, medido por el total de la eficiencia radiante (fotones / s) / (mW / cm 2) ± sem. (C) Representación en vivo bioluminiscente y señales fluorescentes superpuestos en una fotografía en blanco y negro imagen de los ratones. El límite de detección de la carga bacteriana in vivo usando bioluminiscente de imágenes es de entre 1 x 10 2 y 1 x 10 3 UFC. * P &lt;0,05, † p &lt;0,01, ‡ p &lt;0,001 ratones infectados Xen29 frente a los ratones sham-infectados (prueba t de Student [dos colas]). Por favor,en cuenta que es una figura representativa que incluya los datos publicados previamente generados usando Xen29 y fotografiados con el sistema de imágenes IVIS Lumina XR 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3D μCT imágenes. S. aureus Xen29 o no bacterias (no infectados) se inocularon en la articulación de la rodilla después de la colocación de Kirschner y los ratones fueron imágenes utilizando el Quantum FX en vivo sistema μCT. (A) Representante representaciones 3D μCT de Xen29 ratones infectado con (paneles superiores) y los ratones sham infectados (paneles inferiores). (B) Porcentaje de cambio de volumen de hueso exterior (25% distal de los fémures) normalizada a la TI inicialme punto (media ± SEM). * P &lt;0,05, † p &lt;0,01, ‡ p &lt;0,001 ratones infectados Xen29 frente a los ratones sham-infectados (prueba t de Student [dos colas]). Tenga en cuenta que esto es una figura representativa que incluya los datos publicados previamente generados utilizando la cepa bioluminiscente S. aureus Xen29 y fotografiada con el FX en vivo μCT sistema 16 imágenes Quantum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/Movie_1.mpg" target="_blank">Película 1</a> . Representante 3D co-registro anatómico de las señales bioluminiscentes Xen29 y las señales fluorescentes-EGFP neutrófilos en combinación con las imágenes μCT. Las imágenes se giran en el eje vertical.

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Combined In vivo Optical and Ãƒâ€šÃ‚ÂµCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso.

Combinado<em&gt; En vivo</em&gt; Óptica y μCT imágenes para vigilar la infección, inflamación y Hueso anatomía en una infección de implantes ortopédicos en ratones

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