Name: extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Jeg takker følgende personer for deres assistance i udviklingen af ​​denne protokol: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier og Mays Imad. Massespektrometri og proteomics data blev erhvervet af Arizona Proteomics Consortium støttet af NIEHS tilskud ES06694 til SWEHSC, NIH / NCI tilskud CA023074 til AZCC og af BIO5 Institute på University of Arizona. Finansieringen af ​​dette arbejde blev leveret fra National Institutes of Health (National Institute for Almen Medicin) fra tilskud 1F32GM83661-01 og 1R15GM097714-01 til Jessica E. Garb.

1. Fremstilling af Electro-stimulator Apparatus <ol><li> Slut elektro-stimulator strømledningen i stikkontakten og vedhæfte ekstern fodpedal til input eksternt signal. Bemærk: Elektriske ledninger skal isoleres og udsat metal leverer strøm bør ikke berøres. Bær latex eller nitril handsker til beskyttelse. Electro-stimulator afbryder bør være i OFF position, når du sætter strømkablet og vedhæfte ledninger. </li><li> Forbind positiv elektrode til rød output terminal på elektro-stimulator (når polaritet switch er i normal tilstand) og tilslut den negative elektrode til den sorte output terminal. Bemærk: Hver elektrode wire, bør bringe i et krokodillenæb. </li><li> Indstil stimulator til følgende anbefalede startindstillinger: spænding = 7 V, Frekvens = 1 pulser pr sekund, delay = 0 millisekunder, varighed = 200 millisekunder, to pulser skifte = regelmæssig og mode switch = off. </li><li> Test produktion af elektroder ved at knytte krokodillenæb til voltmeter positive og negative testledninger. Tænd stimulator strømmen og levere strøm med fodpedal. </li></ol> 2. Fremstilling af immobilisering pincet og andre materialer <ol><li> Dyp en gren af ​​fjervægts pincet til flydende plast belægning og vente i fire timer for at lade belægning tørre. Stramt wrap 15 mm fra spidsen af ​​den modstående tand med et enkelt lag af bomuld sytråd, og sikre tråd ved at binde ende i en knude. Bemærk: Tråden anvendes til at absorbere en anvendt saltopløsning, der fremmer elektrisk ledningsevne, mens plastbelægningen isolerer at forsinke strømmen. </li><li> Skære spidsen af ​​stump kanyle med en skarp saks og glat åbningen med sandpapir. Fastgør nålen til et vakuum vandlås (f.eks vakuumfilter kolbe) via en slange. Bemærk: Nålen vil suge væk vand og gylper, og vil tjene til at slutte kredsløbet skabt af stimulator elektroder. Nåleåbningen must være lille nok til ikke at skade edderkoppen, men stor nok til at vakuum opløsning uden tilstopning (fx 25 G x 1 ½ i sporvidde, se Materialer List). </li><li> Position fjervægts pincet vandret i en tæt lukket position ved hjælp af en vinyl-dækket tostrenget klemme fastgjort til en magnetisk base eller apparat fast stativ under et dissektionsmikroskop synsfelt, med plastbelagt gren af ​​tang på toppen og tråd belagt prong på bunden. Bemærk: De to-strenget klemme holdes i en stationær position til den magnetiske base ved en klemme holder (se Materialer List). En elastik kan være stramt fastgjort omkring krogene af fjervægts pincet, ved siden af ​​klemmeholderen, at tilføje yderligere pres for at holde fjervægts pincet i en lukket position rundt edderkoppen gang indført. </li><li> Vedhæft positive elektrode krokodillenæb til tang &#39;bund gren opstrøms af tråd og vedhæfte negative krokodillenæb at sløve metal vakuum nål. </li&gt; <li> Test kredsløb strøm med voltmeter ved at placere positive ledning på pincet gren mellem tråd og krokodillenæb og placere negative ledning på stump vakuum nål. Tryk fodpedal til at sikre opdages tilstrækkelig strøm og fjern ledningerne, hvis der registreres tilstrækkelig strøm. </li><li> Forbered flere mikrokapillært rør til gift samling. Hold en enkelt mikrokapillære rør i den ene ende med en behandsket hånd og ved den anden ende med sterile metal pincet placere pincet holdte ende vandret over en bunsenbrænder flamme. Træk på mikrokapillærrøret med metal pincet væk fra flammen til at skabe en aflang spids, mens du holder den anden ende i en stationær position. Bemærk: Brug beskyttelsesbriller som mikrokapillærer nemt kan fraktur. </li><li> Hvile tilberedte mikrokapillærer på et monterings kit strimmel i en petriskål. Undersøg mikrokapillært ender under et dissektionsmikroskop og skabe en lille, skrå åbning trak ende med steriliserede metal pincet. </li><li> Label variabelt antal af sterile 0,5 ml rør. Tilføj sterilt, deioniseret vand til sterile rør (fx 5 pi autoklaveret deioniseret vand). Luk rør og placere rør på is. </li><li> Forbered saltopløsning i et bægerglas og fylde et andet bægerglas med autoklaveret vand. </li></ol> 3. Immobilisering af Spider i Tang <ol><li> Tænd CO 2 tank og overføre edderkop fra lukkede plast indsamle hætteglas (se Materialer List) til CO 2 kammer med lange metal pincet. Bemærk: Black Widow edderkopper har farlig gift; altid bære handsker under denne protokol. </li><li> Hold edderkop i kammer i 5-10 minutter, eller indtil bedøvede og ikke længere bevæger sig, når blidt puffede med lange pincet. Brug overførselspipetten til våd tråd på pincet med saltvandsopløsning. Bemærk: For retningslinjer for CO 2 anæstesi parametre for sorte enker, henvises til Spagna og Moore 19. </li><li> Hent bedøvede edderkop fra CO 2kammer ved at tage det op med sine forreste ben ved stump Dissecting pincet og behandskede hænder. Flyt bedøvet spider at fjervægt pincet apparat. Separate kroge lukkede fjervægts pincet og placere edderkoppens cephalothorax ind mellem tænderne og lade tænderne til at lukke lukket for at sikre edderkop holdes stramt på plads, men er ikke at blive knust. Sørg for, at edderkoppen er placeret Rygskjold dorsum side nedad (se Foelix 20 for vejledning til edderkop anatomi), der hviler på tråd belagt gren, og rygskjoldet er ventrale side mod plastik belægning, mens den positive elektrode forbliver fastgjort til bunden gren. Arbejde hurtigt, når du håndterer edderkop. </li><li> Juster dissektionsmikroskop forstørrelse, fokus og lyskilde indtil edderkoppens chelicerae og hugtænder er klart synlige. </li></ol> 4. Venom Collection <ol><li> Tænd vakuum og spray edderkop chelicerae med vand løsning med en anden stump spids sprøjte nEedle. Sug væk vand med vakuum nål til at fjerne urenheder. </li><li> Rør ved vakuum nål med vedhæftet negative elektrode til edderkop talerstolen og levere puls med fodpedal en eller flere gange. Vakuum væk gylpe hvis det er nødvendigt. Bemærk: spider talerstolen er inde i munden posterior at chelicerae på dorsale overflade mellem chelicerae og Enditer (se Foelix 20 for detaljeret edderkop anatomi). Bemærk: Med hver puls, vil edderkoppen ben kontrakt, og gift være synlig som klare dråber nye fra hugtænder. </li><li> Saml gift dråber med mikrokapillær spids og overførsel kapillar tip i 0,5 ml rør med vand eller buffer opløsning (opløsning vil blive suget ind i kapillær). Bemærk: Undgå at punktere edderkop med kapillær, som kan føre til hæmolymfe forurening og død. Også undgå forurening af kapillar med silke og lim fra spindevorter. </li><li> Fastgør sprøjten overførsel med slange adapter til mikrokapillært (ultimo modsat indsamling tip) og dispense gift opløsning tilbage i røret. Læg røret på is. Bemærk: Bortskaf affald kapillærer i en nærliggende affaldsbeholder. </li><li> Placer åben plast indsamle hætteglas, sammen med sin kasket, tæt på edderkoppen. Grib forsigtigt spider ben med stumpe Dissecting pincet holdes i den ene hånd og forsigtigt åbne fjervægt pincet stikben med derimod glidende edderkop i indsamling hætteglas med stumpe pincet og hurtigt tæt cap. Fortsæt med næste spider og gemme venom-holdige rør i -80 ° C fryseren, når du er færdig. Bemærk: fortsætte med at udvise forsigtighed, når du flytter edderkop fra tangen tilbage i hætteglasset. Sørg for, at indsamling hætteglasset og hætten er nærliggende at edderkoppen for sin hurtig overførsel og bære handsker. </li></ol> 5. Venom Gland Dissektioner <ol><li> To til tre dage efter gift indsamling, bedøver edderkop i CO 2 kammer (se trin 3.1). Fyld flydende nitrogen bærer og sted siden dissektionsmikroskop. Bemærk: whDA arbejder med flydende nitrogen, beskyttelse brug øjet og kryogene handsker. </li><li> Ren dissektion område og dissekere pincet med løsning, der eliminerer RNase og DNA-kontaminering. Fyld en lille petriskål placeret under dissektionsmikroskop med dissekere buffer (f.eks 1x saltvand-natriumcitrat (SSC) buffer). </li><li> Transfer spider fra CO 2 kammer til petriskål og pincet for hurtigt at adskille cephalothorax fra maven. </li><li> Hold cephalothorax under dissektionsmikroskop med en pincet og placer chelicerae i synsfeltet. Bruge de skarpe ender af en anden tang til at skære kutikula sammenføjning rygskjoldet til de laterale aspekter af chelicerae. Lateralt forstå chelicerae hjælp af det andet tang, og forsigtigt slæbebåd og tilbage indtil gift kirtler er trukket ud. </li><li> Separate kirtler fra chelicerae (eller lad knyttet til chelicerae hvis det ønskes) og overføres til en cyrosafe 0,5 ml rør. Place closed rør i flydende nitrogen. Bemærk: Hver dissektion bør ikke tage mere end 15 min. </li><li> Gentag dissektion med ekstra edderkopper indtil færdig. Overfør rør fra flydende nitrogen til -80 ° C fryser. </li></ol>

<ol>
	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

Forfatteren har ikke noget at afsløre og ingen konkurrerende finansielle interesser.

Gifte udgør en vigtig kilde til fysiologisk reaktive proteiner, peptider og andre molekyler med ansøgninger om drug discovery, samt for grundlæggende aspekter af cellulær og økologisk forskning 1-3. Men indsamling af gift, især fra farlige eller små dyr, er en udfordrende opgave. Denne protokol viser, hvordan gift og gift kirtler kan indsamles fra sorte enke edderkopper, og bekræfter succesen af denne tilgang via en kombination af MuDPIT analyse af giften og et protein database stammer fra cDNA&#39;er klonet fra gift kirtler 21. Mens denne protokol fungerer godt for sorte enker og mellemstore edderkopper, andre gift indsamling teknikker er blevet anvendt for større mygalomorph (tarantula-lignende) edderkopper, såsom direkte aspiration af gift fra hugtænder i glas pipetter fx 24. Denne sidstnævnte fremgangsmåde, dog , ikke vil fungere godt for de mindre og mellemstore edderkopper, der ikke er aggressive. En særlig kritisk aspekt af giften indsamlingen protokollen beskrevet her, er de indledende faser af forberedelse og optimering af indsamlingen, således at det bliver mere rutine, konsekvent og hurtigere. Protokollen er indledningsvis udfordrende at mestre, men med gentagne forsøg, bliver det lettere og hurtigere. Forsigtighed er også opfordrede på alle kritiske faser, der involverer håndtering af farlige edderkopper, anvendelse af elektrisk strøm, fin-punkts glas mikro kapillærer, og sprøjte nåle. Det er vigtigt at bære egnede personlige værnemidler såsom nitrilhandsker, en kittel, lange bukser og lukkede sko, samt briller, når udformningen af ​​mikro kapillærer. Et andet udfordrende aspekt gift samling er den lille mængde gift produceret af én edderkop, især Latrodectus arter, hvorfra de opkrævede beløb kan ligrænset til 1-2 mikroliter per individ i bedste fald. At opnå tilstrækkelig gift for downstream applikationer, såsom proteingeler eller funktionelle assays kan kræve en kombination af gift fra flere individer ind i et rør. I sådanne tilfælde bør gift kun kombineres fra individer af samme køn, ontogenetiske scene, og befolkning givet anerkendelse af interseksuel, udviklingsmæssige og geografisk variabilitet i nogle gifte 25, 26. Edderkopper kan også udvise betydelig variation i mængden af ​​gift produceret blandt individer, hvor mindre mængder kan afspejle den seneste udtynding af kirtel. Således kan det være tilrådeligt at indsamle gift flere dage efter sidste fodring. Hvis lille gift er frigivet, bør overdreven strøm ikke anvendt til edderkoppen, som kan forårsage neglebånd til at briste, hvilket fører til forurening af giften med hæmolymfe eller død. Forurening af venom prøver med edderkop silk eller humane kilder bør også undgås ved brug af sterile eller rent udstyr. På trods af disse udfordringer, indsamling af ren gift, forlader spider live, er at foretrække frem for metoder, der opnår gift fra kirtel homogenater (som ikke adskille venom komponenter fra andre cellulære proteiner) og dræbe edderkoppen. Det er også vigtigt at sikre, at prøverne hurtigt er frosset for at forhindre proteinnedbrydning. Udvindingen af ​​gift fremmer senere gift produktionen og derved stimulere gift genekspression i giften kirtel. Således fordi denne protokol giver mulighed for edderkopper til at overleve gift udtømning, deres kirtler kan dissekerede flere dage senere (dræbe spider) i et punkt, hvor gift genekspression forventes at være tilstrækkeligt til genetiske undersøgelser, såsom afskrift kloning 10,11. Skal også tages flere vigtige forholdsregler i giften kirtel dissektioner. Der bør lægges vægt på ved hjælp af lab udstent og reagenser, som er fri for RNaser, som nedbryder RNA. Det anbefales derfor at tørre tang og andre ikke-disponible udstyr og overflader med løsninger, der eliminerer RNase og DNA-kontaminering. De dissektioner bør udføres så hurtigt som muligt og umiddelbart frosset til yderligere at sikre RNA integritet af vævet. Endelig bør dissektioner kun udføres på bedøvede edderkopper, efter deres cephalothorax og underliv er hurtigt adskilt. Afslutningsvis denne artikel giver en verificeret protokol til at opnå edderkoppegift og gift kirtler. Venom og gift kirtler mulighed for isolering og karakterisering af deres protein- og peptid-komponenter ved hjælp af proteomik og transkriptomisk tilgange. Derudover kan venom prøver repræsentere udgangspunktet for funktionelle assays, som er bestemmende for biomedicin og farmakologiske potentialet i deres konstituerende molekyler. Næsten alle edderkopper producerer gift, og den brede dykkerfoldighed af venom komponenter syntetiseret af de enkelte arter tyder på en bred mangfoldighed af venom molekyler endnu at blive opdaget 13. Derfor denne protokol giver værktøjer til at undersøge den rig kilde til biologisk aktive molekyler til stede i edderkoppegifte.

Gifte er dyresekreter overvejende injiceres i et andet dyr med henblik på prædation eller forsvar, og har også vigtige biologiske applikationer med biomedicinsk relevans 1-3. Kun visse dyr syntetisere gift, men dens produktion er taksonomisk udbredt på tværs af hvirvelløse dyr (fx cnidarianer, kegle snegle, skorpioner og edderkopper) og hvirveldyr (f.eks slanger, nogle fisk og pattedyr), fordi det uafhængigt har udviklet sig flere gange 1,4 . Biokemisk karakterisering af gifte viser de typisk er sammensat af en lang række proteiner og peptider, som stort set virker på kredsløbssygdomme og nervesystem injicerede dyr til hurtigt at levere bestanddele toksiner 1. En lille del af giftige dyr kan udgøre en trussel for mennesker, især arter med synanthropic distributioner 5. Studiet af gift sammensætning og funktionelle aktiviteter har spillet en vigtig rolle iden funktionelle karakterisering af hvirveldyr cellulære komponenter (især neuronale ionkanaler) 6 og i at belyse grundlæggende cellulære processer (f.eks neurosekretion) 7. Desuden skal du vælge gift peptider har nyttige egenskaber i biomedicinske sammenhænge, ​​herunder deres anvendelser som behandlinger for kræft og smerte 8,9, og udvindes for kandidatlægemiddel kundeemner og antivenom udvikling. Gifte også spille fremtrædende roller i økologisk og evolutionær forskning 1,4,10,11, og dermed indsamlingen af disse farlige sekreter har mange forsyningsselskaber. Der er&gt; 40.000 beskrevne arter af edderkop (Order Araneae), og alle, men en af de mere end 100 spider familier besidder parret gift kirtler, der ender i hugtænder 12. Den høje artsdiversitet af edderkopper tyder på, at de repræsenterer den største clade giftige organismer. Men biokemisk karakterisering af edderkoppegifte har largely koncentreres om et lille antal arter oftest forbundet med menneskers envenomation. Seneste proteom og transkriptom studier af edderkoppegifte angiver, at de typisk indeholde mange unikke proteiner og peptider 2,13,14. Fremskridt i high-throughput cDNA sekventering og massespektrometri peptid fingeraftryk har i høj grad lettet opdagelsen af disse venom proteiner 15. Ikke desto mindre er dette arbejde begynder med indsamlingen af tilstrækkeligt gift og / eller gift kirtler fra edderkopper, og detaljeret dokumentation for sådanne teknikker er få 16. Denne artikel præsenterer en protokol for indsamling af gift og gift kirtler fra sorte enke edderkopper, som kan anvendes på samme størrelse edderkopper. Indsamlingen af ​​gift adskilt fra kirtler muliggør identifikation af proteiner, der udskilles i giften i modsætning til proteiner, der udfører andre cellulære funktioner. Sorte enker og andre Latrodectus arter er bredt anerkendt som værende blandt de mest farlige edderkopper på grund af deres yderst neurotoksisk gift, der forårsager alvorlige smerter hos mennesker, som er undertiden ledsaget af voldsomme svedeture, muskelsammentrækninger, hypertension, vejrtrækningsbesvær og fragmentarisk lammelse 5. Giften samling protokol præsenteres her bruger elektro-stimulation til at levere elektrisk strøm til bedøvede edderkopper til at fremkalde muskelsammentrækninger og udslip af gift. Venom dråber hurtigt opsamles med mikro-kapillærer og dispenseres i rør til opbevaring fryser. Fordi protokollen involverer farlige procedurer, bør det kun udføres af veluddannede individer, og forsigtighed presses på centrale trin. Den opsamlede gift har mange anvendelsesmuligheder, såsom karakterisering og isolering af konstituerende molekyler 2 af fysiologiske eksperimenter eller funktionelle assays 18, og for at stimulere gift genekspression 11. Protokollen slutter med en descr, hvis ekspression er blevet vist iption af gift kirtel dissektion og bevarelse anvendelige til kloning af gift-specifikke gener at forekomme 2-3 dage efter gift udtømning i forskellige edderkopper 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Gifte er kemisk komplekse sekreter typisk omfatter talrige proteiner og peptider med forskellige fysiologiske aktiviteter. Funktionel karakterisering af venom proteiner har vigtige biomedicinske anvendelser, herunder fastlæggelse af narkotikarelaterede kundeemner eller prober til cellulære receptorer. Edderkopper er den mest artsrige clade af giftige organismer, men gifte på kun få arter er godt forstået, dels som følge af vanskelighederne forbundet med at indsamle små mængder af gift fra små dyr. Denne artikel præsenterer en protokol for indsamling af gift fra edderkopper ved hjælp af elektrisk stimulation, der viser proceduren på den vestlige sorte enke (Latrodectus hesperus). Den opsamlede gift er anvendelig til forskellige downstream analyser herunder direkte protein identifikation via massespektrometri, funktionelle assays, og stimulering af gift genekspression for transkriptomisk studier. Denne teknik har den fordel i forhold til protokoller, isosent gift fra hele homogenater kirtel, som ikke adskiller ægte gift bestanddele fra cellulære proteiner, som ikke udskilles som en del af giften. Repræsentative resultater viser påvisningen af ​​kendte venom peptider fra den opsamlede prøve ved hjælp af massespektrometri. Proceduren gift samling efterfølges af en protokol til at dissekere edderkoppegift kirtler, og resultaterne viser, at dette fører til karakterisering af gift-udtrykte proteiner og peptider på sekvens niveau.

Indsamling af gift og gift kirtel dissektioner ofte udført for at karakterisere venom proteiner og peptider på sekvensniveauet 10,11,15. Samlede gift kan også anvendes i fysiologiske analyser for at bestemme deres funktionelle aktiviteter 18. Indsamlingen af gift vil stimulere gift kirtel genekspression, hvilket letter kloning af specifikke toksin transkripter via RT-PCR 10,11. Identifikation af venom proteiner kan også opnås i en high-throughput måde ved at integrere faste massespektrometriteknikker med sekvensdatabaser genereret fra giften kirtel-cDNA-biblioteker 15,21. Et eksempel på et sådant arbejde, startende fra gift og kirtler, der er indsamlet under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, der viser sin effektivitet, er illustreret i figur 1. Venom indsamlet fra L. Hesperus voksne hunner blev fordøjet med trypsin og udsættes for et i opløsningMuDPIT analyse, som forbinder HPLC (højtydende væskekromatografi) til tandem-massespektrometri (MS / MS). Her MuDPIT analyse blev udført af University of Arizona Proteomics Consortium. Masser af detekterede peptider og deres dissocierede fragmenter (datterioner, udledes spektre) blev sammenlignet med peptidsekvenser teoretisk forudsagt fra oversættelser af cDNA-sekvenser opnået fra et gen-ekspression bibliotek konstrueret fra L. Hesperus gift kirtler (kirtler blev erhvervet af dissektion protokollen beskrevet ovenfor) 21. I dette eksperiment blev 36 proteiner detekteret fra alle indsamlede spektre ved sandsynlighed tærsklen på 99,9% og indeholdt mindst én detekteret peptid. En af de detekterede proteiner understøttes af 43 total spektre (exemplar spektre vist i figur 1A), svarende til tre eksklusive peptider, der dækker 35% af proteinsekvensen (figur 1B). Den detekterede protein (oversat fra en opsamlet<html> d cDNA) har en top BLASTP hit at latrodectin fra L. tredecimguttatus (GenBank P49125.1) med en e-score på 2e-46 og deler 80% identitet på aminosyresekvens niveauet med proteinet påvist i dette forsøg. Latrodectin, som også er kendt som alfa-latrotoxin lav molekylvægt protein, er en anerkendt gift komponent black widow spiders 22, 23, verificere effektiviteten af den præsenterede protokol. Nogle proteiner identificeret fra giften svarer til sekvenser, for hvilke der ikke findes BLAST hit. Det er uklart, hvorvidt et sådant resultat skyldes de begrænsede genomiske ressourcer til rådighed for edderkopper samt begrænsede funktionelle oplysninger til deres proteiner, eller fordi det ukendte protein repræsenterer en gift forurenende stof. Alligevel gen eller protein ekspression analyser undersøge overflod af et sådant hidtil ukendt protein i gift kirtler i forhold til andre væv, afsløre, om det er en ægte gift komponent. ent &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figur 1: Latrodectin peptid identificeret fra black widow gift anvendelse af massespektrometri (A) repræsentant spektre (en af 43) detekteres via MS / MS del af MuDPIT analyse af L.. hesperus gift, der blev tildelt til forudsagt oversættelse af en samlet cDNA sekvens vist i del B. Spectra viser masse at opkræve ratio (m / z) for de registrerede datterioner på den vandrette akse, der er produceret ved fragmentering forælder peptid (CGEEDFGEEIVK), med bogstaver på top angiver peptidsekvensen baseret på datter ion masserne. (B) Protein sekvens som spektre i del A blev tildelt, viser i rød, fed og understreget tekst den tilsvarende sekvens fra spektrene er vist i del A, yderligere rød tekst (ikke fed) repræsenterer et andet peptid i dette protein detekteres med andre indsamlede spECTRA. Proteinsekvensen er oversat fra en cDNA-sekvens opnået fra dissekerede gift kirtler.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Udvinding af Venom og Venom Gland Microdissections fra edderkopper for proteomiske og transkriptom Analyser

Denne artikel indeholder en protokol til ekstraktion af gift fra edderkopper ved hjælp af elektrisk stimulation med henblik på at 1) udføre proteomiske karakterisering, 2) stimulere gift kirtel genekspression, og 3) udføre funktionelle undersøgelser af gifte. Dette efterfølges af en beskrivelse af gift kirtel microdissections for genekspressionsstudier.

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomiske Prøveforberedelse fra formalin Faste og Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Udvinding og analyse af Cortisol fra menneske og Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Kvantitativ Expression Screening og oprensning Anvendt til rekombinant disulfid-rige Venom Proteiner fremstillet i<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Vævssamling og RNA-udvinding fra human osteoarthritic knee joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Ekstraktion, mærkning og oprensning af afstamningsspecifikke celler fra humane antrale follikler

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...