Name: extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Jeg takker følgende personer for deres hjelp i utviklingen av denne protokollen: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, og Mays Imad. Massespektrometri og proteomikk data ble kjøpt av Arizona Proteomikk Consortium støttes av NIEHS stipend ES06694 til SWEHSC, NIH / NCI stipend CA023074 til AZCC og ved BIO5 Institute ved University of Arizona. Midler til dette arbeidet ble gitt fra National Institutes of Health (National Institute of General Medicine) fra tilskudd 1F32GM83661-01 og 1R15GM097714-01 til Jessica E. Garb.

1. Utarbeidelse av elektro-stimulator Apparatus <ol><li> Koble elektro-stimulator nettkabelen i stikkontakten og koble eksterne fotpedal til den eksterne signalinngang. Merk: Elektriske ledninger må være skikkelig isolert og eksponert metall levere strøm skal ikke røres. Bruk gummi eller nitrilhansker for beskyttelse. Elektro-stimulator strømbryter skal være i OFF posisjon når du fester strømledningen og feste ledninger. </li><li> Koble positive elektroden til rødt utgangsterminalen på elektro-stimulator (når polaritet bryteren er i normal modus) og koble den negative elektroden til den svarte utgangsterminalen. Merk: Hver elektrode wire bør opphøre i en alligator klipp. </li><li> Sett stimulator til følgende anbefalte startinnstillinger: spenning = 7 V, Frekvens = 1 pulser per sekund, delay = 0 millisekunder, varighet = 200 millisekunder, twin pulser bytte = vanlig, og modusbryter = off. </li><li> Test produksjon av elektroder ved å feste krokodilleklemmer til voltmeter positive og negative testledninger. Slå på stimulator strømbryteren og levere strøm med fotpedal. </li></ol> 2. Utarbeidelse av Immobiliserende tang og andre materialer <ol><li> Dypp en spiss av featherweight tang til flytende plastbelegg og vente fire timer for å la belegget tørke. Tett vikle 15 mm av spissen på motstander spiss med et enkelt lag av bomull sytråd, og sikre tråden ved å knytte enden i en knute. Merk: Den tråd som brukes for å absorbere en anvendt saltoppløsning som fremmer elektrisk ledningsevne, mens plastbelegg gir isolasjon for å retardere strømmen. </li><li> Skjær tuppen av stump kanyle med skarp saks og glatt åpningen med sandpapir. Fest nålen til et vakuum avfall felle (f.eks vakuum filter kolbe) via rør. Merk: Nålen vil suge bort vannet og regurgitate, og vil bidra til å fullføre krets skapt av stimulator elektroder. Nålen åpning must være liten nok til å ikke skade edderkoppen, men likevel stor nok til å vakuum løsning uten tilstopping (f.eks 25 G x 1 ½ i tykkelse ser Materials List). </li><li> Posisjon featherweight tang horisontalt i en tett lukket posisjon ved hjelp av en vinyl-dekket todelt klemme festet til en magnetisk base eller fast stativ apparat under et disseksjonsmikroskop synsfelt, med plastbelagt spiss tang på toppen og tråd belagt spiss på bunnen. Merk: todelt klemme holdes i ro til den magnetiske basen ved en klemme holderen (se Materials List). En gummibånd kan være tett festet rundt pinnene på de featherweight tang, ved siden av klemholderen, for å legge til ekstra kraft for å holde de featherweight tang i en lukket stilling rundt en gang innført edderkoppen. </li><li> Fest positive elektroden alligator klipp til tang &#39;nederst spiss oppstrøms tråden og fest negative alligator klipp å sløve metall vakuum nål. </li&gt; <li> Test krets oppdatert med voltmeter ved å plassere positive ledningen på tang spiss mellom tråden og alligator klipp og plassere negative bly på stump vakuum nål. Trykk på pedalen for å sikre nok strøm oppdages og fjerne ledningene hvis tilstrekkelig strøm er oppdaget. </li><li> Forbered flere microcapillary rør for gift samlingen. Hold en enkelt microcapillary rør i den ene enden med en hansker hånd og i den andre enden med sterile metall tang, plassere tang holdte enden horisontalt over en Bunsen brenner flammen. Trekk i microcapillary med metall tang bort fra flammen til å opprette en langstrakt spiss, samtidig som holder den andre enden i en stasjonær stilling. Merknad: Bruk vernebriller som mikrokapil lett kan sprekke. </li><li> Hvil forberedt mikrokapil på en monterings kitt stripe i en petriskål. Undersøke microcapillary ender under et dissekere mikroskop og lage en liten, skrå åpning trakk enden med steriliserte metall tang. </li><li> Label variabelt antall av sterile 0,5 ml rør. Legg sterilt, deionisert vann til sterile rør (for eksempel, 5 ul autoklavert deionisert vann). Lukk rør og plassere rørene på is. </li><li> Forbered saltoppløsning i et beger og fylle et annet begerglass med vann autoklaveres. </li></ol> 3. Immobilisering av Spider i pins <ol><li> Slå på CO 2 tank og overføre edderkopp fra lukket plast samle hetteglass (se Materials List) i CO 2 kammer ved hjelp av lange metall tang. Merk: black widow edderkopper har farlig gift; alltid hansker i løpet av denne protokollen. </li><li> Hold edderkopp i kammeret for 5-10 min eller til bedøvet og ikke lenger beveger seg når dyttet forsiktig med en lang tang. Bruk overføringspipetten til våt tråd på tang med saltvannsoppløsning. Merk: For retningslinjer for CO 2 anestesi parametere for svarte enker, se Spagna og Moore 19. </li><li> Hent bedøvet edderkopp fra CO 2kammer ved å plukke den opp ved sin fremre ben med butte dissecting pinsett og hansker. Flytt bedøvet edderkopp å Fjær tang apparat. Separate utstikkerne av lukkede featherweight pinsett og plasser edderkopp cephalothorax i mellom utstikkerne og la de utstikkerne å stenge stengt for å sikre edderkopp holdes godt på plass, men er ikke å bli knust. Sørg for at edderkoppen er plassert ryggskjoldet ryggen side nedover (se Foelix 20 for guide til edderkopp anatomi), hviler på tråden belagt spiss, og ryggskjoldet er ventral siden som vender mot plastbelegg, mens den positive elektroden forblir festet til bunnen spiss. Arbeid raskt ved håndtering edderkopp. </li><li> Juster dissekere mikroskop forstørrelse, fokus og lyskilde til edderkopp Chelicer og hoggtenner er klart synlig. </li></ol> 4. Venom Collection <ol><li> Slå på vakuum og spray edderkopp Chelicer med vann løsning ved hjelp av en annen stump tippet sprøyte needle. Suge bort vannet med vakuum nål for å fjerne urenheter. </li><li> Trykk på vakuum nål med vedlagt negative elektroden til edderkopp talerstol og levere puls med fotpedal én eller flere ganger. Vacuum bort regurgitate om nødvendig. Merk: edderkopp talerstol er inni munnen posterior å Chelicer på framsiden mellom Chelicer og endites (se Foelix 20 for detaljert edderkopp anatomi). Note: Med hver puls, vil edderkoppen ben kontrakt, og giften være synlig som klare dråper dukker opp fra fangs. </li><li> Samle venom dråper med microcapillary tuppen og tuppen kapillær overføring inn i 0,5 ml rør med vann eller bufferløsning (løsningen vil bli sugd inn i kapillar). Merk: unngå punktering edderkopp med kapillær som kan føre til hemolymph forurensning og død. Også unngå forurensning av kapillær med silke og lim fra spinnerets. </li><li> Fest transfer sprøyte med røradapter til microcapillary (på slutten motsatt samling tip) og dispense gift oppløsning tilbake i røret. Sett røret på is. Merk: Kast avfallskapillærer i en nærliggende beholder for skarpe gjenstander. </li><li> Plasser åpen plast samle hetteglass, sammen med sin cap, i nærheten av edderkoppen. Gripe edderkopp ben nøye med butt dissecting tang holdt i den ene hånden og forsiktig åpne fjærvekt tang utstikkerne med andre hånden, skyve edderkopp på å samle hetteglass med butt pinsett og raskt tett lokk. Fortsett med neste edderkopp og lagre gift holdige rør i -80 ° C fryser når du er ferdig. Merk: fortsette å utvise forsiktighet når du flytter edderkoppen fra tang tilbake i hetteglasset. Forsikre deg om at oppsamlingshetteglasset og lokket er i nærheten til edderkoppen for sin raske overføring og bruk hansker. </li></ol> 5. Venom Gland disseksjoner <ol><li> To-tre dager etter gift samling, bedøve edderkopp i CO 2 kammer (se trinn 3.1). Fyll flytende nitrogen bærer og sted ved siden dissekere mikroskop. Merk: whno arbeider med flytende nitrogen, beskyttelse bruk øyet og kryogeniske hansker. </li><li> Ren disseksjon området og dissekere pinsett med løsning som eliminerer RNase og DNA-kontaminering. Fyll en liten petriskål plassert under dissekere mikroskop med dissekere buffer (f.eks 1x saltvann-natriumsitrat (SSC) buffer). </li><li> Transfer edderkopp fra CO 2 kammer til petriskål og bruke tang for å raskt skille cephalothorax fra magen. </li><li> Hold cephalothorax under dissekere mikroskop med pinsett og plasser Chelicer i synsfeltet. Bruk skarpe endene av et sekund pinsett til å kutte hårstråene bli med i ryggskjoldet til de laterale aspekter av Chelicer. Sideveis gripe Chelicer bruke den andre pinsett og forsiktig napp frem og tilbake til gift kjertlene er trukket ut. </li><li> Skill kjertler fra Chelicer (eller la knyttet til Chelicer om ønskelig) og overføring til en cyrosafe 0,5 ml tube. Plasser closed rør i flytende nitrogen. Merk: hver disseksjon bør ikke ta mer enn 15 min. </li><li> Gjenta disseksjon med flere edderkopper til ferdig. Overføringsrørene fra flytende nitrogen til -80 ° C fryser. </li></ol>

<ol>
	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

Forfatteren har ingenting å avsløre og ingen konkurrerende finansielle interesser.

Gifter representerer en viktig kilde til fysiologisk reaktive proteiner, peptider og andre molekyler med søknader om medisiner, samt for grunnleggende aspekter av mobilnettet og økologisk forskning 1-3. Men innsamling av giften, særlig fra farlige eller små dyr, er en utfordrende oppgave. Denne protokollen viser hvordan gift og gift kjertler kan hentes fra black widow edderkopper, og bekrefter suksess for denne tilnærmingen via en kombinasjon av mudpit analyse av gift og en protein database avledet fra cDNAs klonet fra gift kjertler 21. Mens denne protokollen fungerer godt for svarte enker og mellomstore edderkopper, andre gift samling teknikker har vært ansatt i større mygalomorph (tarantella-aktig) edderkopper, for eksempel direkte aspirasjon av giften fra hoggtenner i glass pipetter for eksempel 24. Denne sistnevnte tilnærming, men , ikke vil fungere godt for mindre store edderkopper som ikke aggressive. Et spesielt viktig aspekt av gift samling protokollen beskrevet her er de innledende faser av fremstillingen og optimalisering av innsamlingsprosessen, slik at det blir mer rutine, konsekvent og raskere. Protokollen er i utgangspunktet utfordrende å mestre, men med gjentatte forsøk, blir det lettere og raskere. Forsiktighet er også oppfordret til alle kritiske faser som involverer håndtering av farlige edderkopper, bruk av elektrisk strøm, fin-point glassmikrokapillærer, og sprøytespisser. Det er viktig å bruke egnet personlig verneutstyr som nitrilhansker, en labfrakk, lange bukser og lukkede sko, samt briller når du forme mikrokapillærer. Et annet utfordrende aspekt til gift samlingen er den lille mengden av gift produsert av noen edderkopp, spesielt Latrodectus arter, der beløpene samlet kan være liMited til 1-2 mikroliter per individ i beste fall. Innhente tilstrekkelig gift for nedstrøms applikasjoner, for eksempel protein gels eller funksjonelle analyser kan kreve en kombinasjon av gift fra flere individer i en tube. I slike tilfeller bør gift kun kombineres fra individer av samme kjønn, ontogenetisk stadium, og befolkningen gitt anerkjennelse av intersex, utviklingsmessige og geografiske variasjoner i enkelte venoms 25, 26. Edderkopper kan også utvise stor variasjon i hvor mye gift som produseres blant enkeltpersoner, der mindre mengder kan gjenspeile den siste uttømming av kjertelen. Dermed kan det være lurt å samle gift flere dager etter deres siste fôring. Hvis lite gift slippes, bør mye strøm ikke brukes til edderkoppen, som kan føre til at skjellaget til å sprekke, noe som fører til forurensning av gift med hemolymph eller død. Forurensning av gift prøver med edderkopp silk eller menneskelige kilder bør også unngås gjennom bruk av sterilt eller rent utstyr. Til tross for disse utfordringene, samling av ren gift, slik at edderkoppen i live, er å foretrekke å skaffe fremgangsmåter som gift fra homogenater kjertel (som ikke skiller gift komponenter fra andre cellulære proteiner) og drepe edderkoppen. Det er også kritisk for å sikre at prøver blir hurtig frosset for å hindre at proteinnedbrytingen. Utvinning av giften fremmer senere gift produksjon, og dermed stimulere gift genuttrykk i giften kjertelen. Således, fordi denne protokollen tillater edderkopper å overleve venom uttømming, deres kjertler kan bli dissekert flere dager senere (drepe edderkoppen) på et punkt hvor venom genekspresjon er forventet å være tilstrekkelig for genetiske studier, for eksempel transkripsjon kloning 10,11. Flere viktige forholdsregler må også tas i gift kjertel disseksjoner. Bør det legges vekt på å bruke lab utstyr;ent og reagenser som er fri for RNases som bryter ned RNA. Dermed anbefales det å tørke tang og andre ikke-engangsutstyr og overflater med løsninger som eliminerer RNase og DNA-kontaminering. Disseksjonene bør utføres så raskt som mulig, og direkte frosset for ytterligere å sikre integriteten av RNA vevet. Til slutt, disseksjoner bør bare utføres på bedøvede edderkopper, etter deres cephalothorax og abdomen er raskt separert. I konklusjonen, gir denne artikkelen en verifisert protokollen for å få edderkopp gift og gift kjertler. Venom og gift kjertler tillate for isolering og karakterisering av sine proteiner og peptider komponenter ved hjelp av proteomikk og transcriptomic tilnærminger. I tillegg kan gift prøvene representerer startpunktet for funksjonelle analyser, som bestemmer den biomedisinske og farmakologiske potensialet i sine bestanddelsmolekyler. Nesten alle edderkopper produserer gift, og den brede dykkertetet i gift komponenter syntetisert av enkeltarter antyder et stort mangfold av gift molekyler er ennå ikke oppdaget 13. Følgelig gir denne protokollen verktøy for å undersøke rik kilde av biologisk aktive molekyler tilstede i edderkoppgift.

Gifter er dyr sekreter hovedsakelig injisert inn i et annet dyr med henblikk på predasjon eller forsvar, og har også viktige biologiske applikasjoner med biomedisinsk relevans 1-3. Bare visse dyr syntetisere gift, men produksjonen er taksonomisk utbredt over virvelløse dyr (f.eks, nesledyrene, kjegle snegler, skorpioner og edderkopper) og virveldyr (f.eks, slanger, noen fisk og pattedyr), fordi den har uavhengig utviklet seg flere ganger 1,4 . Biokjemisk karakterisering av gifter viser vanligvis de er sammensatt av et bredt utvalg av proteiner og peptider, noe som i stor grad virke på sirkulasjons- og nervesystemene hos injiserte dyr å raskt levere en konstituerende toksiner. En liten brøkdel av giftige dyr kan utgjøre en trussel for mennesker, spesielt arter med synanthropic distribusjoner 5. Studiet av gift sammensetning og funksjonelle aktiviteter har spilt en viktig rolle ifunksjonell karakterisering av virveldyr cellulære komponenter (spesielt nevronale ionekanaler) 6 og i å belyse grunnleggende cellulære prosesser (f.eks neurosekresjon) 7. Videre velger gift peptider har nyttige egenskaper i biomedisinske sammenhenger, inkludert deres anvendelser som behandlinger for kreft og smerter 8,9, og er minelagt for kandidat narkotika fører og antivenom utvikling. Gifter også spille fremtredende roller i økologisk og evolusjonær forskning 1,4,10,11, og dermed innsamling av disse farlige sekreter har mange verktøy. Det er&gt; 40 000 beskrevne arter av edderkopp (Order Araneae), og alle unntatt én av de mer enn 100 edderkoppfamilier besitter paret gift kjertler som avsluttes i fangs 12. Den høye artsmangfoldet av edderkopper tyder på at de representerer den største clade av giftige organismer. Imidlertid har biokjemisk karakterisering av edderkoppgift largely konsentrert på et lite antall arter oftest forbundet med menneskelig envenomation. Nyere proteomikk og transcriptomic studier av edderkopp venoms indikerer de vanligvis inneholder mange unike proteiner og peptider 2,13,14. Fremskritt i høy gjennomstrømming cDNA sekvensering og massespektrometri peptid fingerprinting har i stor grad oppdagelsen av disse gift proteiner 15. Likevel begynner slikt arbeid med innsamling av tilstrekkelig gift og / eller gift kjertler fra edderkopper, og detaljert dokumentasjon for slike teknikker er få 16. Dette notatet presenterer en protokoll for innsamling av gift og gift kjertler fra black widow edderkopper, som kan brukes på samme størrelse edderkopper. Samlingen av venom separat fra kjertlene muliggjør identifisering av proteiner som skilles ut i giften i motsetning til andre cellulære proteiner som utfører funksjoner. Svarte enker og andre Latrodectus arter er anerkjent for å være blant de farligste edderkoppene på grunn av deres svært nevrotoksisk gift, som forårsaker store smerter hos mennesker, som er noen ganger ledsaget av rikelig svette, muskelsammentrekninger, høyt blodtrykk, pustevansker og usammenhengende lammelser 5. Giften samling protokoll som presenteres her bruker elektrostimulering for å levere elektrisk strøm til bedøvede edderkopper å lokke fram muskelsammentrekninger og frigjøring av giften. Venom dråper blir raskt innhentet med mikrokapillærer og utlevert til rør for fryselager. Fordi protokollen innebærer farlige prosedyrer, bør det bare utføres av godt utdannede personer og forsiktighet oppfordret på viktige skritt. Det oppsamlede venom har en rekke anvendelser, som for eksempel karakterisering og isolering av bestanddelsmolekyler 2, for fysiologiske eksperimenter eller funksjonelle analyser 18, og for å stimulere venom genekspresjon 11. Protokollen avsluttes med en description av venom kjertel disseksjon og bevaring nyttig for kloning av gift-spesifikke gener, hvis ekspresjon er vist å forekomme 2-3 dager etter venom uttømming i forskjellige edderkopper 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Gifter er kjemisk komplekse sekreter vanligvis omfatter flere proteiner og peptider med varierte fysiologiske aktiviteter. Funksjonell karakterisering av gift proteiner har viktige biomedisinske applikasjoner, inkludert identifisering av narkotika ledninger eller sonder for cellulære reseptorer. Edderkopper er den mest artsrike clade av giftige organismer, men gift på bare noen få arter er godt forstått, delvis på grunn av vanskelighetene forbundet med å samle inn ørsmå mengder av giften fra små dyr. Dette notatet presenterer en protokoll for innsamling av gift fra edderkopper ved hjelp av elektrisk stimulering, demonstrere prosedyren på den vestlige sorte enke (Latrodectus Hesperus). De innsamlede gift er nyttig for varierte nedstrøms analyser inkludert direkte protein identifisering via massespektrometri, funksjonelle analyser, og stimulering av gift genuttrykk for transcriptomic studier. Denne teknikken har den fordelen over protokoller som isosent gift fra hele kjertel homogenates, som ikke skiller ekte gift komponenter fra cellulære proteiner som ikke er utskilt som en del av giften. Representative resultater demonstrerer deteksjon av kjente gift peptider fra den oppsamlede prøven ved hjelp av massespektrometri. Giften samling prosedyre følges av en protokoll for å dissekere edderkoppgift kjertler, med resultatene som viser at dette fører til karakterisering av gift-uttrykte proteiner og peptider ved sekvensnivå.

Samlingen av gift og gift kjertel disseksjoner er ofte utført for å karakterisere gift proteiner og peptider i sekvensen nivå 10,11,15. Oppsamlet venom kan også anvendes i fysiologiske analyser for å bestemme deres 18 funksjonelle aktiviteter. Samlingen av giften vil stimulere gift kjertel genekspresjon, og dermed legge til rette for kloning av spesifikke toksin transkripsjoner via RT-PCR 10,11. Identifisering av gift-proteiner kan også bli oppnådd i en high-throughput måte ved å integrere standard massespektrometriteknikker med sekvensdatabaser generert fra venom kjertel cDNA-bibliotek 15,21. Et eksempel på et slikt arbeid, fra giften og kjertler som samles ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor, vist å være effektiv, er illustrert i figur 1. Venom hentet fra L. Hesperus voksne hunner ble spaltet med trypsin og underkastet en in oppløsningenMudpit analyse, som forbinder HPLC (væskekromatografi med høy ytelse) til tandem massespektrometri (MS / MS). Her mudpit analyse ble utført ved University of Arizona Proteomikk Consortium. Masser av oppdagede peptider og deres dissosierte fragmenter (datterioner, inferred fra spektra) ble sammenlignet med peptidsekvenser teoretisk spådd fra oversettelser av cDNA sekvenser hentet fra en genuttrykk bibliotek konstruert fra L. Hesperus gift kjertler (kjertler ble ervervet av disseksjon protokollen beskrevet ovenfor) 21. I dette eksperiment ble 36 proteiner detektert fra alle spektra oppsamlet, ved 99,9% sannsynlighetsterskel, og inneholdt minst en detektert peptid. En av de detekterte proteiner er støttet av 43 total-spektra (eksemplar spektra er vist på figur 1A), svarende til tre eksklusive peptider, som dekker 35% av proteinsekvensen (figur 1B). Den oppdaget protein (oversatt fra en oppsamlet<html> d cDNA) har en topp BLASTp hit til latrodectin fra L. tredecimguttatus (GenBank Accession P49125.1), med en e-score på 2e-46, og deler 80% identitet til aminosyresekvensen i nivå med påvises i dette forsøket protein. Latrodectin, som også er kjent som alfa-latrotoxin lavmolekylært protein, er en anerkjent venom-komponent av svart enke edderkopper 22, 23, verifisere effektiviteten av den presenterte protokollen. Noen proteiner identifisert fra giften tilsvarer sekvenser som ingen BLAST hit er funnet. Det er uklart om et slikt resultat er på grunn av de begrensede genomiske ressurser tilgjengelig for edderkopper samt begrenset funksjonell informasjon for sine proteiner, eller fordi det ukjente protein representerer en gift forurensning. Likevel gen eller protein ekspresjon analyser undersøke overflod av et slikt nytt protein i gift kjertler i forhold til andre vev skal avsløre hvorvidt det er et ekte venom-komponent. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figur 1: Latrodectin peptid identifisert fra svart enke gift ved hjelp av massespektrometri (A) Representant spektra (en av 43) oppdaget via MS / MS delen av mudpit analyse av L.. Hesperus venom som ble tilordnet til oversettelse av en forutsagt oppsamlet cDNA sekvensen vist i del B. Spectra viser masse å lade forholdet (m / z) av detekterte datterioner på den horisontale aksen fremstilt ved fragmentering av moder peptid (CGEEDFGEEIVK), med bokstaver på toppen indikerer peptidsekvens basert på datteren ion massene. (B) Protein sekvens som spektra i del A ble tildelt, viser i rødt, fet og understreket tekst tilsvarende sekvens fra spektra vist i del A, ekstra rød tekst (ikke fet) representerer en annen peptid i dette proteinet oppdages med andre innsamlet spectra. Proteinsekvensen er oversatt fra en cDNA-sekvens hentet fra dissekert gift kjertler.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Utvinning av Venom og Venom Gland Microdissections fra Spiders for proteomikk og Transcriptomic Analyser

Denne artikkelen gir en protokoll for utvinning av gift fra edderkopper som bruker elektrisk stimulering for å 1) gjennomføre proteomikk karakterisering, 2) stimulere gift kjertel genuttrykk, og 3) utføre funksjonelle studier av gift. Dette etterfølges av en beskrivelse av gift kjertel microdissections for genuttrykk studier.

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomikk Prøvepreparering fra formalinfiksert og parafin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Utvinning og analyse av kortisol fra Menneske og Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Høy gjennomstrømning Kvantitativ Expression Screening og rensing Anvendt til Rekombinant Disulfide-rike Venom proteiner som produseres i<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Vevsinnsamling og RNA-ekstraksjon fra den humane osteoarthritic kneleddet

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Ekstraksjon, merking og rensing av avstamningsspesifikke celler fra humane antralfollikler

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...