Name: extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Я благодарность следующим людям за их помощь в развитии этого протокола: Чак Кристенсен, Грета Бинфорд, Алекс К. Ланкастер, Конрад Zinsmaier и Mays Имада. Масс-спектрометрия и протеомика данные были приобретены Аризона протеомики консорциума при поддержке NIEHS гранта ES06694 к SWEHSC, NIH / NCI грант CA023074 к AZCC и по BIO5 института Университета Аризоны. Финансирование этой работы была предоставлена ​​из Национального института здоровья (National Institute общей медицины) от грантов 1F32GM83661-01 и 1R15GM097714-01 до Джессика Е. наряд.

1. Подготовка Электро-стимулятор аппарата <ol><li> Подключите электро-стимулятор шнур питания к розетке и подключите внешний педаль для внешнего входного сигнала. Примечание: Электрические провода должны быть надежно изолированы и подвергаются металл доставки ток не должны быть затронуты. Носите латексные или нитриловые перчатки для защиты. Выключатель питания Электро-стимулятор должен быть в положении ВЫКЛ при подключении шнура питания и крепления проводов. </li><li> Подключение положительный электрод к выходному разъему красного на электро-стимулятора (когда переключатель полярности находится в нормальном режиме) и подсоединить отрицательный электрод с выходным выводом черного. Примечание: Каждый электрод провод должен прекратить в крокодил. </li><li> Установите стимулятор для следующих рекомендуемых начальных установок: напряжение = 7 V, частота = 1 импульсов в секунду, задержка = 0 мс, продолжительность = 200 миллисекунд, две импульсы переключения = обычная, и переключатель режима = выключен. </li><li> Контрольный выход из электродов путем присоединения зажимами для voltmeтер положительные и отрицательные щупы. Включите выключатель питания стимулятора и доставить ток с педалью. </li></ol> 2. Подготовка щипцы иммобилизации и другие материалы <ol><li> Опустите одну зубец полулегком пинцетом в жидком пластиковым покрытием и ждать четыре часа, чтобы позволить покрытия в сухом месте. Плотно оберните 15 мм кончика противоположной зубца с одним слоем ниток хлопчатобумажных швейных и закрепите нить, связывая конец в узел. Примечание: нить используется для поглощения прикладной физиологический раствор, что способствует электрической проводимости, в то время как пластиковое покрытие обеспечивает изоляцию для замедления тока. </li><li> Вырезать кончик тупой иглы для подкожных инъекций с острыми ножницами и сгладить открытие с наждачной бумагой. Приложите иглу к вакуумной отходов ловушку (например, вакуум-фильтра колбы) через трубки. Примечание: игла всасывания от воды и пересказывают, и будет служить для замыкания цепи, созданной стимулятор электродов. Открытие игла муул быть достаточно малы, чтобы не нанести вред паука, но достаточно большой, чтобы вакуумного решения без засорения (например, 25 G х 1 ½ в колеи, см список материалов). </li><li> Позиция в полулегком щипцы горизонтально в плотно закрытом положении с помощью виниловым покрытием двусторонний зажим, прикрепленный к магнитным основанием или постоянной аппарата стенда под полем вскрытии микроскоп зрения, с пластиковым покрытием зубец щипцов сверху и нить покрыта зубец на нижней. Примечание: двусторонний зажим поддерживается в стационарном положении на магнитном основании с помощью держателя зажима (см список материалов). Резинкой может быть плотно закреплены вокруг зубцами полулегком щипцов, рядом с держателем зажима, чтобы добавить дополнительное давление, чтобы держать в полулегком щипцов в закрытом положении вокруг паука раз ввел. </li><li> Прикрепите положительный зажим электрода аллигатора в нижней зубец щипцов »перед резьбой и приложить отрицательное крокодил, чтобы притупить металла вакуумный иглу. </li&gt; <li> Замыкания с вольтметра путем размещения положительный вывод на щипцов зубец между нитью и крокодил и размещения отрицательный провод от тупой вакуумной иглой Тест. Нажмите педаль, чтобы обеспечить достаточный ток обнаруживается и удалить ведет, если достаточный ток обнаруживается. </li><li> Подготовьте несколько микрокапиллярной трубы для сбора яда. Удерживая одну микрокапиллярной трубу на одном конце с рукой в ​​перчатке и на другом конце с стерильных металлических щипцов, поместив конец щипцов-горизонтально над пламенем горелки Бунзена. Потяните на микрокапилляр с металлическими щипцами от пламени, чтобы создать удлиненную наконечник, удерживая другой конец в стационарном положении. Примечание: носить защитные очки, как микрокапилляры можете легко перелом. </li><li> Отдых подготовленные микрокапиллярах на монтажной замазки полосы в чашке Петри. Изучите микрокапиллярных заканчивается под микроскопом рассекает и создать небольшой, скошенный отверстие в вытащил конце со стерильными металлическими щипцами. </li><li> Лябел переменное число стерильных 0,5 мл пробирки. Добавить стерильной деионизированной воды, чтобы стерильные пробирки (например, 5 мкл деионизированной воды автоклавного). Закрыть трубы и место трубки на льду. </li><li> Приготовьте солевой раствор в химический стакан и заполнить втором стакане с водой в автоклаве. </li></ol> 3. Иммобилизация Паук в щипцы <ol><li> Включите CO 2 танка и перенести паука из закрытой пластиковой сбора флакона (см список материалов) в СО 2 камеры с помощью длинных металлических щипцов. Примечание: черные пауки вдовы имеют опасную яд; всегда носите перчатки во время этого протокола. </li><li> Держите паука в камере в течение 5-10 мин или до наркозом и больше не двигаться, когда мягко ткнул с длинными щипцами. Используйте пипетки передачи мочить нить на щипцы с физиологическим раствором. Примечание: Рекомендации по CO 2 параметров анестезии для черных вдов, относятся к Испании и Мур 19. </li><li> Получить наркозом паука из CO 2камера, выбирая его по его передних ног с использованием тупых рассекает щипцов и руки в перчатках. Перемещение наркозом паука полулегком щипцы аппарат. Отдельные зубцы закрытых полулегком пинцетом и поместить головогрудь паука между зубцами и позволяют зубцы, чтобы закрыть запорный обеспечить паука проводится крепко на месте, но не быть раздавленным. Убедитесь, что паук находится панцирь тыльной стороной вниз (см Foelix 20 для руководства к паука анатомии), опираясь на нити покрыты зубцами, и брюшная сторона панциря в перед пластиковое покрытие, в то время как положительный электрод остается прикрепленной к нижней вилке. Работают быстро при обращении паука. </li><li> Отрегулируйте не рассекает микроскопа увеличение, фокус, и источник света, пока хелицер паука и клыки четко видны. </li></ol> 4. Яд Коллекция <ol><li> Включите вакуум и спрей паука хелицеры с водным раствором, используя второй тупой наконечником шприца пeedle. Всасывания в сторону воды с вакуумной иглой для удаления примесей. </li><li> Сенсорный вакуумный иглу с прикрепленной отрицательного электрода к паука трибуны и доставить импульс с педаль один или более раз. Вакуумная от пересказывают при необходимости. Примечание: паук трибуна находится внутри рта кзади, чтобы Хелицеры на спинной поверхности между хелицер и endites (см Foelix 20 для детального паука анатомии). Примечание: При каждом импульсе, ноги контракт паука, и яд будет виден в виде прозрачных капель, выходящих из клыков. </li><li> Соберите яд капли с кончика микрокапиллярной и передачи капиллярного кончика в 0,5 мл пробирку с водой или буферным раствором (раствор будет втягиваться в капилляр). Примечание: во избежание проколов паука с капилляра, которые могут привести к загрязнению гемолимфы и смерти. Также во избежание загрязнения капилляра с шелком и клеем из фильеры. </li><li> Прикрепите передачи шприц с адаптером трубка для микрокапилляр (на конце, противоположном кончике сбора) и гispense яд решение вернуться в трубке. Поместите трубку на льду. Примечание: Утилизировать капилляров отходов в соседнем контейнер для острых предметов. </li><li> Разместить пластиковую сбора флакон, вместе с его крышкой, рядом с пауком. Аккуратно возьмите паука ноги с тупыми Препаровальный щипцы в одной руке и осторожно откройте полулегком щипцы штыри с другой стороны, раздвижные паука в сборе флакон с тупыми щипцами и быстро тесном крышкой. Продолжить с рядом пауков и магазинов яда содержащих труб в -80 ° C морозильнике, когда закончите. Примечание: по-прежнему проявлять осторожность при перемещении паука от щипцов обратно в пузырек. Убедитесь, что сбор флакон и крышка находится неподалеку от паука для ее быстрой передачи и в перчатках. </li></ol> 5. ядовитой железы Вскрытия <ol><li> Два-в-три дня после сбора яда, обезболить паука в СО 2 камеры (см шаг 3,1). Заполните жидкий носитель азота и место рядом с рассекает микроскоп. Примечание: белыйан работе с жидким азотом, защита использование глаз и криогенных перчатки. </li><li> Чистый район рассечение и рассечения щипцы с раствором, что исключает РНКазы и ДНК загрязнения. Заполните небольшую чашку Петри, размещенный под микроскопом рассекает с рассечения буфер (например, цитрат 1x солевой раствор-натрия (SSC) буфере). </li><li> Передача паук из CO 2 камеры на чашке Петри и использовать пинцет, чтобы быстро отделить головогрудь с живота. </li><li> Держите головогрудь под микроскопом рассекает с пинцетом и поместить хелицеры в поле зрения. Используйте острые концы второй парой щипцов, чтобы вырезать кутикулу присоединения к панцирь к боковым аспектов хелицер. Сбоку понять хелицеры, используя вторую пару щипцов и аккуратно потяните вперед и назад, пока яд железы не вытащил. </li><li> Отдельные железы от хелицер (или оставить прикрепленные к Хелицеры при желании) и перевод на cyrosafe трубки 0,5 мл. Место Клосаред трубки в жидкий азот. Примечание: каждый рассечение следует принимать не более 15 мин. </li><li> Повторите рассечение с дополнительными пауков пока не закончено. Передача трубки из жидкого азота в -80 ° C морозильнике. </li></ol>

<ol>
	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

Автор не имеет никакого отношения к раскрытию и никаких конкурирующих финансовых интересов.

Ядов представляют собой важный источник физиологически реактивных белков, пептидов и других молекул с приложениями для открытия новых лекарств, а также для фундаментальных аспектов клеточного и экологических исследований 1-3. Тем не менее, сбор яда, особенно от опасных или мелких животных, является сложной задачей. Этот протокол показывает, как яд и ядовитых желез могут быть собраны из черная вдова пауков, и подтверждает успех этого подхода через комбинации MuDPIT анализа яда и базы данных белка, полученного из кДНК клонированного из ядовитых желез 21. Хотя этот протокол работает хорошо для черных вдов и средних пауков, другие методы сбора яда были использованы для увеличения mygalomorph (тарантулов, как) пауков, например, прямой аспирации яда от клыков в стеклянные пипетки например, 24. Этот последний подход, однако , не будет хорошо работать для меньшего размера пауков, которые не aggressiве. Один особенно важный аспект протокола сбора яда, описанной здесь начальные фазы подготовки и оптимизации процесса сбора, так что она становится все более рутинной, последовательным и быстрее. Протокол изначально сложным в освоении, но при повторных испытаниях, становится легче и быстрее. Внимание также призвал на всех критических этапах, связанных с обращение с опасными пауками, использование электрического тока, тонкой точка стеклянные микро капилляров и шприцев иглы. Важно носить соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитриловые перчатки, лабораторный халат, длинные брюки и закрытые туфли, а также очки при формировании микро капилляров. Другой аспект сложной сбора яда является небольшое количество яда получены любым одним паука, в частности видов, Latrodectus, из которого суммы собранных может быть Liраничена 1-2 мкл на индивида в лучшем случае. Получение достаточного яд для последующих применений, таких как белковые гели или функциональных анализов может потребоваться сочетание яда из нескольких индивидуумов в одну пробирку. В таких случаях, яд должен сочетаться только с особями того же пола, стадии онтогенеза, и население, учитывая признание межполовых, развития и географической изменчивости в некоторых ядов 25, 26. Пауки могут также проявлять значительные различия в размере яда производится среди лиц, где меньшие количества могут отражать недавнее истощение железы. Таким образом, может быть целесообразным, чтобы собрать яда через несколько дней после их последнего кормления. Если немного яда освобождается, чрезмерного тока не должна применяться к пауку, что может привести кутикула к разрыву, что приводит к загрязнению ядом с гемолимфы или смерти. Загрязнение образцов яда паука сиLk или человека источники также следует избегать за счет использования стерильных или чистых оборудования. Несмотря на эти проблемы, сбор чистого яда, оставляя паука живьем, предпочтительнее методов, которые получают яд от железы гомогенатах (которые не отдельные компоненты яда от других клеточных белков) и убить паука. Исключительно важно также, чтобы гарантировать, что образцы быстро замораживали, чтобы предотвратить деградацию белков. Добыча яда способствует последующему производство яда, тем самым стимулируя экспрессию генов яда в ядовитой железы. Таким образом, из-за этого протокола позволяет пауки выжить истощение яда, их желез может быть расчленены на несколько дней позже (убийство паука) в точке, где экспрессия гена яд, как ожидается, будет достаточно для генетических исследований, таких как расшифровка клонирование 10,11. Несколько важных мер предосторожности должны быть приняты в яд железы вскрытий. Акцент должен быть сделан на использовании лабораторного ОснасткаЛОР и реагенты, которые свободны от РНКаз которые разрушают РНК. Таким образом, рекомендуется протереть щипцов и других не-одноразовое оборудование и поверхностей с помощью решений, устраняющих РНКазы и ДНК загрязнения. В вскрытия должна быть выполнена как можно быстрее и непосредственно замороженные в дальнейшем обеспечить целостность РНК из ткани. Наконец, вскрытия должна быть выполнена только на наркозом пауков, после их головогрудь и брюшко быстро разошлись. В заключение этой статьи предусматривает проверить протокол для получения яда паука и ядовитых желез. Venom и ядовитых желез позволяют выделения и характеристики их белковых и пептидных компонентов с использованием протеомные и транскриптомных подходы. Кроме того, образцы яда может представлять начальную точку функциональных анализов, определяющих биомедицинских и фармакологических потенциал своих учредительных молекул. Почти все пауки производят яд, а широкая дайверплотность яда компонентов, синтезируемых отдельных видов предполагает обширное разнообразие молекул яда еще предстоит открыть 13. Соответственно, этот протокол обеспечивает средства, чтобы исследовать богатый источник биологически активных молекул, присутствующих в ядов пауков.

Яды выделениями животных преимущественно вводят в другое животное для целей хищничества или обороны, а также имеют важные биологические приложения с биомедицинской актуальности 1-3. Только некоторые животные синтезировать яд, но его производство таксономически широко распространены беспозвоночных (например, книдарий, моллюсков-конусов, скорпионов, пауков и) и позвоночных (например, змей, некоторых рыб и млекопитающих), потому что он самостоятельно развивалась несколько раз в 1,4 , Биохимические характеристики ядов, как правило, показывают, что они состоят из широкого спектра белков и пептидов, которые в основном действуют на кровеносную и нервной систем, инъецированных животных, чтобы быстро доставить составные токсины 1. Небольшая часть ядовитых животных может представлять угрозу для человека, особенно видов с синантропных распределений 5. Изучение состава яда и функциональной деятельности играет важную роль вфункциональные характеристики позвоночных клеточных компонентов (в частности, нейронные ионные каналы) 6 и в выяснении фундаментальные клеточные процессы (например нейросекрета) 7. Кроме того, выберите яда пептиды обладают полезными свойствами в биомедицинских контекстах, в том числе их использование в качестве средства лечения рака и боли 8,9, и добываются на кандидатов приводит наркотиков и развития против змеиного яда. Ядов также играют заметную роль в экологическом и эволюционном исследований 1,4,10,11, таким образом, коллекция этих опасных выделений имеет множество утилит. Есть&gt; 40000 описанных видов пауков (порядка Пауки), и все, кроме одного из пауков семей более чем 100 обладают парных ядовитых желез, которые оканчиваются в клыков 12. Видовое разнообразие высокой пауков предполагает, что они представляют собой крупнейший клад ядовитых организмов. Однако биохимические характеристики ядов пауков есть лargely сосредоточено на небольшом количестве видов наиболее часто связанных с человеческой укуса. Последние протеомные и транскриптомных исследования ядов пауков указывают, что они, как правило, содержат много уникальных белков и пептидов 2,13,14. Достижения в области высокой пропускной кДНК последовательности и масс-спектрометрии пептидов дактилоскопии значительно облегчило открытие этих ядовитых белков 15. Тем не менее, такая работа начинается со сбора достаточного яда и / или ядовитых желез из пауков и подробной документации для таких методов мало 16. Эта статья представляет собой протокол для сбора яда и ядовитых желез из черная вдова пауков, которые могут быть применены к подобного размера пауков. Сбор яда отдельно от желез позволяет идентифицировать белки, которые секретируются в яд, в отличие от белков, выполняющих другие клеточные функции. Черные вдовы и другие Lвиды atrodectus широко признаны одними из самых опасных пауков в связи с их высокой нейротоксической яда, который вызывает сильную боль у человека, который иногда сопровождается обильным потоотделением, мышечных сокращений, гипертонии, затрудненное дыхание и пятнистый паралича 5. Протокол коллекция яд, представленные здесь использует электростимуляции доставить электрический ток для анестезии пауков, чтобы вызвать мышечные сокращения и высвобождения яда. Капли яда быстро собрали с микро-капилляров и разливают в пробирки для хранения морозильной. Поскольку протокол включает опасные процедуры, она должна быть выполнена только с помощью хорошо обученных людей, и осторожность призвал на ключевых шагов. Собранный яд имеет множество применений, таких как характеристики и изоляции учредительных молекул 2, для физиологических экспериментов или функциональных анализов 18, и, чтобы стимулировать экспрессию гена яда 11. Протокол завершается DESCRiption из яда железы диссекции и сохранение полезной для клонирования яда-специфических генов, экспрессия которых было показано, что происходит в 2-3 дней после яда истощение в различных пауков 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Ядов химически сложные выделения, как правило, включающие многочисленные белки и пептиды с различными физиологическими деятельности. Функциональная характеристика ядовитых белков имеет важные биомедицинские приложения, в том числе идентификации приводит наркотиков или зондов для клеточных рецепторов. Пауки являются большинство видов богатой клады ядовитые организмы, но яды лишь несколько видов хорошо понимал, в части из-за трудностей, связанных со сбором мельчайшие количества яда от мелких животных. Эта статья представляет собой протокол для сбора яда из пауков с помощью электрической стимуляции, демонстрируя процедуру на Западной черной вдовы (Latrodectus Геспер). Собранный яд полезен для различных последующих анализов в том числе прямой идентификации белков через масс-спектрометрии, функциональных анализов, и стимуляции экспрессии генов яд для транскриптомных исследований. Эта техника имеет преимущество над протоколами, которые изопоздно яд из целых железы гомогенатах, которые не отделяют подлинные компоненты яда из клеточных белков, которые не секретируемых как часть яда. Типичные результаты демонстрируют обнаружение известных пептидов из яда собранного образца с использованием масс-спектрометрии. Процедура сбора яда следуют протокола для рассечения яда паука желез, с результаты демонстрируют, что это приводит к характеристике яда-экспрессированных белков и пептидов на уровне последовательности.

Коллекция яда и яд железы вскрытий часто выполняются охарактеризовать яда белки и пептиды на уровне 10,11,15 последовательности. Собранные яд также могут быть использованы в физиологических анализов, чтобы определить их функциональную активность 18. Сбор яда будет стимулировать экспрессию гена железы яда, тем самым облегчая клонирование конкретных токсина транскриптов с помощью ОТ-ПЦР 10,11. Идентификация яда белков также может быть выполнена в высокой пропускной образом за счет интеграции стандартных методов масс-спектрометрии с базами данных последовательностей, полученных из яда железы кДНК библиотек 15,21. Примером такой работы, начиная от яда и желез, собранных с использованием протокола указано выше, демонстрируя свою эффективность, показано на рисунке 1. Venom собраны из L. Геспер взрослые самки переваривали трипсином и подвергают в раствореАнализ MuDPIT, которая связывает ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с тандемной масс-спектрометрии (MS / MS). Вот анализ MuDPIT была выполнена в Университете Аризоны протеомики консорциума. Массы обнаруженных пептидов и их фрагментов (диссоциированных ионов дочерние, выведены из спектров), сравнивали с пептидных последовательностей теоретически предсказанные переводов из последовательностей кДНК, полученных из библиотеки экспрессии генов, построенного из L. Геспер ядовитых желез (железы, приобретенные в соответствии с протоколом вскрытия описано выше) 21. В этом эксперименте, 36 были обнаружены белки от всех собранных спектров, на 99,9% -ного порога вероятности, и содержали по крайней мере один пептид обнаружено. Один из обнаруженных белков поддерживается 43 общего спектров (образец спектров показано на фиг.1А), соответствующие трем эксклюзивных пептидов, охватывающих 35% белковой последовательности (Фиг.1В). Обнаруженный протеин (в переводе с collecte<html> d кДНК) имеет максимальную BLASTP хит для latrodectin от L. tredecimguttatus (GenBank, P49125.1), с электронной счетом 2E-46, и разделяет 80% идентичностью на уровне аминокислотной последовательности белка с обнаруженной в этом эксперименте. Latrodectin, который также известен как альфа-latrotoxin низкой белка молекулярной массы, является признанным яд составляющая черной вдовы пауки 22, 23, проверки эффективности представленной протокола. Некоторые белки, определенные из яда соответствуют последовательностям, для которых нет BLAST хитом не найдены. Неясно, является ли такой результат из-за ограниченных геномных ресурсов, доступных для пауков, а также ограниченного функционала информации для своих белков, или из-за неизвестного белка представляет собой яд примеси. Тем не менее, ген или экспрессии белка анализирует изучения обилие такого нового белка в ядовитых желез по сравнению с другими тканями должны выявить, является ли он подлинным компонент яда. ЛОР &quot;л: держите-together.within-страницу =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Рисунок 1: Latrodectin пептид, идентифицированный с черной вдовы яда с помощью масс-спектрометрии () представитель спектры (один из 43) обнаружен с помощью MS / MS части MuDPIT анализа L.. Геспер яд, который был назначен в предсказанной переводе собранной последовательности кДНК, показанной в части В. спектров показывает массы к заряду (m / z) обнаруженных дочерних ионов на горизонтальной оси, полученного путем фрагментации исходного пептида (CGEEDFGEEIVK), с буквами на верхней указывающий на пептидную последовательность на основе дочерних ионов масс. (В) последовательности белка, к которой спектры в части А был назначен, показывающий в красный, жирный и подчеркнутый текст собой соответствующую последовательность из спектров, приведенных в части А, дополнительный красный текст (не жирный) представляет собой еще один пептид в этом белке обнаружен с другой собранной зрectra. Последовательность белка в переводе с последовательностью кДНК, полученной из расчлененных ядовитых желез.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Добыча Venom и Venom железы Microdissections от пауков для протеомные и транскриптомных анализов

Эта статья предусматривает протокол для извлечения яда из пауков с помощью электрической стимуляции в целях: 1) проводить протеомный характеристику, 2) стимулировать экспрессию гена железы яд, и 3) выполнение функциональные исследования ядов. За этим следует описание яд железы microdissections для исследований экспрессии генов.

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Электрофоретического разделения белков

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Цифровой Microfluidics автоматизированного протеомных Обработка

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Индукционная токсина и белка Извлечение из Fusarium Sрр. Культуры для протеомных исследований

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Evisceration стекловидного тела и сетчатки мышь для протеомных Анализы

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Добыча и Анализ кортизола от человека и обезьян волос

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em&gt; Е. палочка</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Экстракция, маркировка и очистка клеток, специфичных для линии, из антральных фолликулов человека

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...