Name: the use of fluorescent target arrays for assessment of t cell responses in vivo
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo at JoVE.com

وأيد هذا العمل عن طريق منح المشروع # 1010395 (بكريل وCP) و # 525431 (CR)، وبرنامج المنح # 455395 (CP) من المجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية في أستراليا، وهو المركز الأسترالي للالتهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية الفيروسات EOI 2012 منحة (CR وRJJ) ومنحة من مؤسسة غوردون وجريتل قسم مشتركي DSL (بكريل وCR). نود أن نشكر Harpreet فوهرا ومايكل Devoy لصيانتها ممتازة من المختبر JCSMR نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومرفق الاسترالية مؤسسة أبحاث السرطان الجزيئية البيولوجية للموارد، JCSMR، انو، لتخليق الببتيد، والدكتور ديفيد بويل، معامل CSIRO للصحة الحيوانية، جيلونج، أستراليا لتوفير الوالد الأسهم قاح فيروس نقص المناعة البشرية.

ملاحظة: تمت معالجة الفئران المستخدمة في إطار هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات تجارب على الحيوانات الجامعة الوطنية الاسترالية والفئران والموت الرحيم من قبل خلع عنق الرحم. 1. صبغ وإعداد الببتيد <ol style=";text-align...

<ol>
	<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+target+array+killing+assay:+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo.">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+target+array+T+helper+assay:+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4++T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo.">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes.">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li><li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens.">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li><li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+multi-gene,+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines.">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li><li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb/C+mouse+model.">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li><li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule.">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry.">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li><li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+(CFSE)+to+monitor+lymphocyte+proliferation.">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VITAL+assay:+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo.">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li><li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection.">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li><li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response.">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li><li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer/antigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays.">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li><li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells.">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies.">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li><li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+(ELISPOT)+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells.">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li><li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells.">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance.">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li></ol>

الاستفادة من اتفاقية التجارة الحرة القائمة على المقايسات هو أنها تسمح للتمييز من&gt; 250 السكان الخلية المستهدفة قابلة للحياة وظيفية بالكامل من حيوان مضيف واحد بواسطة التدفق الخلوي. هذا يوفر مستوى من التعقيد لفي الجسم الحي تتدفق المقايسات مقرها الخلوي الذي لم يكن...

الخلايا التائية تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية التكيفية، وغالبا ما تستهدف التلاعب في العلاج المناعي. CD4 + T المستجيب الخلايا الرد على مستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية التي تنظم جوانب كثيرة من الحصانة ويمكن أن يساعد أيضا الخلايا البائية مباشرة لتصنيع الأجسام المضادة. خلايا CD8 + T السامة للخلايا (CTLs) يمكن أن تستجيب أيضا لمستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية وكذلك تلعب دورا مركزيا في قتل الخلايا مباشرة تعبر عن مستضد الأجنبية. التفاعل الأساسي الذي يبدأ هذه الوظائف المستجيب الخلايا التائية ينطوي على التفاعل بين الخلايا مستقبلات T (TCR) مع الببتيدات الأجنبية المعروضة على جزيئات MHC على سطح الخلايا. خلايا CD4 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC من الدرجة الثانية على مستضد تقديم الخلايا وخلايا CD8 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC-I الطبقة التي عادة ما يتم عرضها على الخلايا المصابة ميكروب. من أجللتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا التائية في الاستجابة المناعية، فمن الضروري أن ظائف المستجيب التي يتم قياسها من خلال تقنيات موثوقة وحساسة. وتشمل الطرق الشائعة لتقييم استجابة الخلايا T؛ MHC class-I/II/peptide tetramer التفاعل؛ إنتاج السيتوكينات التي كتبها ELISPOT والخلايا تلطيخ خلوى؛ وقتل القدرات بنسبة 51 المقايسات الكروم، الإصدار. هذه المقايسات، ومع ذلك، وعادة ما يتم تنفيذ فيفو السابقين مع التحفيز في المختبر، أو تقديم رؤية محدودة في وظيفة خلايا تي. من الناحية المثالية، عند قياس استجابات الخلايا التائية أنه سيكون من المفيد لتقييم لهم في الموقع، في الجسم الحي عند حدوثها، مع عدم وجود التلاعب من الخلايا T وذلك لتجنب التغيرات في المعايير الفنية التي قد تحدث من خلال التحفيز في المختبر. وتستند بعض من الأكثر شيوعا في الجسم الحي الخلايا التائية المقايسات الفنية على قياس القتل CTL بوساطة الخلايا المستهدفة نابض مع الطبقة MHC الببتيدات أنا ملزم بأن يتم تعداد في الجسم الحيعبر الكشف من خلال وضع العلامات الفلورية مع الأصباغ الحيوية مثل CFSE. في حين أن هذه الأنواع من المقايسات يمكن رصد مقتل CTL بوساطة من الأهداف عندما يحدث في الجسم الحي، وكان لديهم في السابق قدرة محدودة نسبيا لتقييم مقتل أهداف متعددة تقديم تركيزات مختلفة وأنواع مختلفة من الحواتم الببتيد، وهو مطلوب للسماح المعلمات النوعية مثل الطمع وظيفية وحاتمة البديل عبر التفاعل ليتم تقييمها. هذه المقايسات أيضا لا توفر أي معلومات عن CD4 + T الخلية بوساطة الاستجابات. للتغلب على العديد من القيود مع الأساليب الحالية المستخدمة لتقييم استجابات الخلايا التائية، وقد وضعنا مؤخرا مقايسة متعددة استنادا صفائف الفلورسنت الهدف (اتفاقيات التجارة الحرة)، والذي يسمح للرصد استجابات الخلايا T ضد&gt; 250 الخلايا المستهدفة في وقت واحد في حيوان واحد من قبل التدفق الخلوي 1، 2. وتتألف اتفاقيات التجارة الحرة من الخلايا الليمفاوية المسمى مع بغازيتركيزات األطراف ومزيج من الأصباغ الحيوية مثل CFSE، CTV وثيقة البرنامج القطري السماح&gt; 250 خلية من مجموعات مضان فريدة لتكون ولدت. لأن هذه الخلايا لا تزال قابلة للحياة وتعمل بكامل طاقتها، ويمكن حقنها في الحيوانات للسماح رصد تفاعلها مع الخلايا التائية المستجيب في الجسم الحي 3. على سبيل المثال، مجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن نابض مع MHC-I-الببتيدات ملزمة الطبقة للسماح تقييم مستضد محددة CTL بوساطة قتل الخلايا المستهدفة 1. بالإضافة إلى ذلك، ومجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن أيضا أن يكون نابض مع الببتيدات MHC الدرجة الثانية ملزمة، مما يتيح تقييم مستضد محددة الخلايا التائية المساعدة (T H) النشاط عن طريق تقييم تفعيل (عن طريق تقييم علامات تفعيل مثل CD69، CD44 و / أو CD62L) من خلايا B ضمن اتفاقية التجارة الحرة التي تحمل الببتيد وما شابه ذلك 2. منذ ويمكن الكشف عن أكثر من 250 أهداف في وقت واحد، فمن الممكن لقياس CTL وT H الاستجابات ضد العديد من مجموعات الخلايا المستهدفة نابض مع nالببتيدات umerous بتركيزات مختلفة وإدراج العديد من مكررات. وبالتالي يوفر الفحص FTA مستوى غير مسبوق من T تقييم استجابة المستجيب خلية في الجسم الحي. نحن هنا تصف بالتفصيل بناء منطقة التجارة الحرة وإظهار الكيفية التي يمكن تطبيقها على تقييم استجابات الخلايا T في الجسم الحي. يصف الإجراء بناء منطقة تجارة حرة تتكون من 252 مجموعات الخلايا ملحوظ من خلال استخدام ثلاثة الأصباغ الحيوية، تتألف من 6 تكرارات من 42 مجموعات الخلايا نابض مع الطبقة MHC-I والببتيدات الثاني ملزم. وضع العلامات من 42 مجموعات الخلايا يحدث في 10 مل المخروطية القاع أنابيب وأنها مفيدة لوضع هذه في رف أنبوب كما هو مبين في الجدول رقم 1. يمكن تعديل هذه الطريقة لأعداد أقل من كتل ملحوظ كما هو مطلوب عن طريق تقليل كمية من وضع العلامات كل صبغة يؤديها 1. نسلط الضوء على فائدة الفحص من خلال إظهار كيف يمكن قياس رد ووفاق الناتجة عن التطعيم للفيروسات جدري المؤتلف ضد الحواتم متعددة في لفيف صغير من الفئران. هذا يبين كيف يمكن استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة لقياس الاستجابات التراكمية والطمع وظيفية من خلال، على التوالي، واستخدام المساحة تحت منحنى (AUC) تقييم وقياس تركيز الببتيد الفعالة اللازمة لتوليد استجابات القصوى نصف (EC 50).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:71px;">Serana</td>
			<td style="width:119px;">FCS-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CTV</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C34557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CFDA, SE</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CPD</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0840-90</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-B220 PerCp-Cy5.5</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">110730</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-CD69 brilliant violet 605</td>
			<td style="width:71px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104529</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">PKH-26</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Material Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source)</td>
			<td style="width:71px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of fluorescent target arrays for assessment of t cell responses in vivo

القدرة على رصد استجابات الخلايا T في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية وتصميم المناعية. نحن هنا وصف استخدام الفلورسنت مجموعة المستهدفة (FTA) والتكنولوجيا، التي تستخدم الأصباغ الحيوية مثل استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE)، البنفسجي ليزر الأصباغ منفعل (CellTrace فيوليت: CTV) والليزر الحمراء الأصباغ منفعل (خلية انتشار صبغ eFluor 670: وثيقة البرنامج القطري ) لcombinatorially الخلايا الليمفاوية الماوس في التسمية&gt; 250 ملحوظ مجموعات الخلايا الفلورسنت. مجموعات الخلايا داخل هذه اتفاقيات التجارة الحرة يمكن نابض مع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الدرجة الأولى والدرجة MHC-II الببتيدات ملزمة، وبالتالي تكون بمثابة خلايا CD8 + الهدف لوخلايا CD4 + T، على التوالي. تبقى هذه الخلايا قابلة للحياة واتفاقية التجارة الحرة تعمل بكامل طاقتها، وبالتالي يمكن أن تدار في الفئران للسماح تقييم CD8 + T قتل بوساطة خلية من الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة وCD4 + T-هيل التأمل الخليةp من اتفاقية التجارة الحرة B الخلايا المستهدفة خلية في الوقت الحقيقي في الجسم الحي بواسطة التدفق الخلوي. منذ&gt; 250 الخلايا المستهدفة يمكن تقييمها في وقت واحد، والأسلوب يسمح رصد استجابات الخلايا T ضد عدة الحواتم المستضد في عدة تركيزات ومكررات متعددة. على هذا النحو، يمكن للتقنية قياس استجابات الخلايا التائية في كل من الكمية (على سبيل المثال حجم التراكمي للاستجابة) والنوعية (على سبيل المثال. الطمع وظيفية وحاتمة عبر التفاعل من الاستجابة) المستوى. هنا، نحن تصف كيفية بناء هذه اتفاقيات التجارة الحرة وتعطي مثالا على الكيفية التي يمكن تطبيقها لتقييم استجابات الخلايا التائية الناجمة عن الفيروس لقاح جدري المؤتلف.

كمثال على استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة، وتحصين BALB / ج الماوس مع فيروس اللقاحية المؤتلف (VV) معربا عن فيروس نقص المناعة البشرية الحواتم-I (VV-HIV) والردود على فيروس نقص المناعة البشرية الحواتم CTL-I، الكمامة، موت الكمامة، تم تقييم الحياة الفطرية وبول، وVV CTL الحواتم F2L ...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo at JoVE.com

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

القدرة على رصد استجابات الخلايا التائية بالتفصيل في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية. نحن هنا وصف استخدام صفائف الهدف الفلورسنت (اتفاقيات التجارة الحرة) في الجسم الحي في فحص الخلايا التائية التي يقيم&gt; 250 معلمات في وقت واحد من قبل التدفق الخلوي.

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

في المختبر و في فيفو التقييم تي وب وخلايا النقوي النشاط القمعية واستجابات خلطيه من المتلقين زرع

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...