Name: combined dna-rna fluorescent in situ hybridization (fish) to study x chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.

1. Inducción de la diferenciación de células madre embrionarias Mujer para inducir inactivación del cromosoma X NOTA: las células madre embrionarias de ratones hembra (disponibles bajo petición) se cultivan en condiciones normales de células ES en placas de cultivo gelatinizados recubiertas con fibroblastos de embriones de ratón (MEFs). Estamos aquí, suponemos que el lector está familiarizado con las técnicas de cultivo celular convencionales 39-41. Para inducir la difere...

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	<li>Rudkin, G. T., Stollar, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+detection+of+DNA-RNA+hybrids+in+situ+by+indirect+immunofluorescence.">High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence.</a> Nature. 265, 472-473 (1977).</li><li>Imataka, G., Arisaka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+analysis+using+spectral+karyotyping+(SKY).">Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY).</a> Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).</li><li>Ross, F. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture.">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li></ol>

Combinado de ADN-ARN FISH puede ser técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN FISH pueden ser demasiado fuertes para las moléculas de ARN menos estables. Varios enfoques se han aplicado al estudio de ambos ADN y el ARN en la misma célula, evitando la necesidad de incubación simultánea con sondas de detectar tanto el ADN y el ARN. Por ejemplo, en un enfoque de superposición, se realiza primero FISH ARN y las células son expuestas, y se toman las coordenadas. Posteriormente, los mismos por...

El estudio de las células y los tejidos mediante hibridación in situ fluorescente (FISH), desde su introducción a finales de 1970 1, permite a los investigadores estudiar los genes, la organización de la cromatina y la expresión génica a nivel subcelular. FISH ADN se utiliza con frecuencia en citogenética, cariotipo 2, el diagnóstico del cáncer 3 y antes de la implantación de cribado genético 4, y tiene un papel importante en la investigación molecular de 5-6, ya que permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo. Análisis de la expresión de células individuales por ARN FISH puede detectar transcritos primarios nativas y RNAs no codificantes que se transcribe a partir de cromosomas, y ofrece ventajas a otras técnicas que evalúan la expresión génica a nivel de población, incluyendo, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, análisis de expresión de todo el genoma o transferencia Northern . Mediante la visualización de las transcripciones de ARN procedentes directamente de sus sitios de origen, ha sido, por ejemplo,se dio cuenta de que la expresión génica es estocástico 7, y, a veces puede ser específica de alelo 8. Las mejoras en la técnica incluso han permitido la detección y cuantificación de moléculas de ARNm individuales dentro de las células 9-11. El principio básico de peces consiste en la hibridación de ácidos nucleicos dentro de la célula a una sonda de ácido nucleico por medio de Watson y Crick de apareamiento de bases altamente específica. La sonda puede ser ya sea directa o indirectamente detectado, dando como resultado una señal que puede ser visualizada microscópicamente. Los intentos iniciales consistieron de sondas marcadas radiactivamente, que tenían inconvenientes sobre la base de las cuestiones de seguridad, resolución espacial limitada y la capacidad de detectar sólo un objetivo a la vez 12-14. El desarrollo posterior de las etiquetas no radiactivos, incluidos fluorocromos, haptenos, y enzimas, ha permitido que el uso generalizado de FISH como una técnica de biología molecular de rutina. La sonda FISH o bien se puede marcar directamente con fluorochromes por reticulación química de moléculas fluorescentes a secuencias de ácido nucleico 15 y la integración de los nucleótidos marcados con fluorescencia 16-19, o la sonda puede ser visualizada indirectamente después de la integración de haptenos (incluyendo biotina y digoxigenina) y detección inmunológica de haptenos por anticuerpos específicos conjugados con haptenos reportero fluorescente moléculas 20-21. El último enfoque permite la amplificación de la señal mediante el uso de varias capas de anticuerpos marcados con fluorescencia que se utilizan para mejorar la señal original, y permite la detección de especies de ARN que se expresan en niveles bajos. Mediante la combinación de técnicas de etiquetado directos e indirectos y diversos haptenos, varios objetivos se pueden visualizar simultáneamente dentro de la misma célula. Uno de los pasos más importantes en los protocolos de pescado es la hibridación de la sonda con su diana. Aunque, en teoría, una sonda específicamente se unirá sólo a su objetivo, en la práctica, esta especificidadno siempre es logrado, como sondas pueden unirse a regiones homólogas, y condiciones de hibridación no siempre será ideal para una especie determinada región de ADN o de ARN. Los lavados post-hibridación son por lo tanto de particular importancia, ya que pueden aumentar el rigor del procedimiento de FISH, y pueden prevenir la unión no específica de sondas FISH, que daría lugar a un alto nivel de ruido de fondo. Como las moléculas de ARN son de cadena simple que puede ser fácilmente hibridó con una sonda de FISH. En contraste, la molécula de ADN de doble hebra primero necesita una etapa de desnaturalización, después de lo cual una sonda se puede hibridar. Esto se consigue normalmente por calentamiento de la muestra, lo que resulta en la desnaturalización del ADN. Sin embargo, bajo estas duras condiciones, moléculas de ARN de cadena simple frágiles podrían perderse. Por lo tanto, ADN-ARN combinado FISH requiere la optimización significativa de las condiciones, y es técnicamente más difícil en comparación con la detección separada de sólo ARN o ADN. Aquí Presenta protocolo detallado de combinado, FISH simultánea de ADN-ARN que ha permitido estudiar la inactivación del cromosoma X (XCI) en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hembra 22-24. XCI es un mecanismo epigenético crucial para el desarrollo embrionario hembra 25, y los resultados en heterochromatinization y por lo tanto, el silenciamiento de uno de los dos cromosomas X en individuos femeninos 26-27. Esencial para este proceso es el ARN no codificante de Xist 28-30, que está regulada por los RNF12 22-23 y REX1 24 proteínas. Expresión de Xist se convierte en upregulated en el futuro cromosoma X inactivo (XI) durante el desarrollo embrionario o la diferenciación de células ES in vitro , y pueden expandirse a lo largo del cromosoma X y, por tanto atraer enzimas remodelación de la cromatina que se traducen en el cierre de la transcripción del cromosoma X 31. Esta difusión de Xist ARN pueden ser visualizados por ARN FISH como un revestimiento de la cromosoma Xalgunos, que también se conoce como una nube de Xist. Dado que las células madre embrionarias femeninas pueden perder uno de sus cromosomas X, debido a la inestabilidad genómica, nosotros y otros han empleado combinado de ADN-ARN FISH para estudiar XCI, para asegurarse de que las células sólo cariotípicamente estables son evaluados en el análisis de este importante proceso 22,32 -34. Al igual que con todas las técnicas de la biología molecular, varios protocolos excelentes diferentes han sido publicados 35-38. Aquí presentamos nuestro método, a partir de la inducción de la diferenciación en células ES de ratón, la fijación de las células, el etiquetado de sondas FISH por traslación de mella, el tratamiento previo de las células fijadas para permitir la permeabilización y captación de sonda posterior, la hibridación de la sonda a la objetivo, y finalmente la detección de la sonda por anticuerpos marcados con fluorescencia. El protocolo aquí presentado permite la fiel detección de Xist ARN y el cromosoma X dentro de un período de dos días, y los fundamentos de esta técnica probablemente se puede adaptar a otsus sistemas y áreas de investigación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">female mouse embryonic stem cells</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">will be made available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse embryonic fibroblasts</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell culture medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM &#223;-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4&#186;C for maximal 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">LIF</td>
			<td style="width:124px;">Chemicon</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11960085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin&#8211;streptomycin (100&#215;)</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Non-essential aminoacids&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">&#223;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell differentiation medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 &#956;l/l monothioglycerol and 50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">IMDM-Glutamax</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Ascorbic acid (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">monothioglycerol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">T25 cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">6-well cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">cell culture grade PBS</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">falcon tubes</td>
			<td style="width:124px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">24x24 mm coverslips</td>
			<td style="width:124px;">Menzle</td>
			<td align="right" style="width:119px;">780882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">gelatin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td>prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 &#7484;C until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20&#7484;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">absolute 100%&#160; ethanol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32221-2.5L</td>
			<td>use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">RNAse free water</td>
			<td style="width:124px;">Baxter</td>
			<td>TKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">sterile filter tips</td>
			<td style="width:124px;">Rainin Bio Clean</td>
			<td style="width:119px;">GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745816910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745824910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Sephadex G50</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2 ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">BD Plastipak</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">sterilized cotton</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf tubes</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">yeast tRNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15401-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse cot-1 DNA&#160; 1 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf bench top microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Eppendorf Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5810R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M NaAc, pH 5.6</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50+ hybridization solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">formamide</td>
			<td style="width:124px;">Acros organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">dextran sulfate</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">pepsin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887</td>
			<td>prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 &#181;l 37% HCL per 100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">HCL, 37% solution&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">object glasses</td>
			<td style="width:124px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">20x SSC</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9763</td>
			<td>dilute to 2x SSC in RNAse free water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">10 mM Phosphate buffer, pH 7</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">denaturation buffer</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tween-20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M Tris pH 7.5 solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tris-Saline-Tween washing solution (TST)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#181;l Tween-20, add RNAse free water till 1 liter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">10x Saline solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline-BSA (TSBSA)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>500 &#956;l 10x Saline, 250 &#956;l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">BSA, purified, 100x&#160;</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">sheep-anti-dig antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:500 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse-anti-biotin antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:200 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline washing solution (TS)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:124px;">Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nail-varnish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">fluorescent miscroscope</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined dna-rna fluorescent in situ hybridization (fish) to study x chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que permite la detección de ácidos nucleicos en las células. FISH de ADN se utiliza a menudo en la citogenética y el diagnóstico del cáncer, y puede detectar aberraciones del genoma, que a menudo tiene importantes implicaciones clínicas. ARN FISH se puede usar para detectar moléculas de ARN en las células y se ha proporcionado información importante en la regulación de la expresión génica. La combinación de ADN y ARN FISH dentro de la misma célula es técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN de pescado podría ser demasiado fuertes para moléculas de ARN de cadena simple frágiles. Damos a conocer un protocolo de fácil aplicación que permite a la combinada, la detección simultánea de Xist ARN y el ADN codificado por los cromosomas X. Este protocolo FISH de ADN-ARN combinado probable que se puede aplicar a otros sistemas en los que necesitan tanto ARN como ADN para ser detectado.

Usando el protocolo antes mencionado para combinado de ADN-ARN FISH, hemos sido capaces de visualizar inactivación del cromosoma X en la diferenciación de células madre embrionarias femeninas. Figura 1 muestra un ejemplo representativo de un experimento FISH de ADN-ARN, donde se detectó tanto Xist (que es visible como una llamada de Xist ARN nube en el cromosoma X inactivo y un puntito basal de transcripción en el cromosoma X activo), y una región del cromosoma X, que es visible ...

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

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Studying DNA and RNA

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