Name: a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity
Uploaded: 2014-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

En. Utarbeidelse av Flue kulturer, løsninger og Embryo håndtering enheter <ol><li> Forbered et bur kultur Drosophila. Plasser 500 + parring fluer ønsket belastning i en befolkning bur utstyrt med en 10 cm drue-agar plate og en flekk av gjær lime. Oppretthold-kultur i en 25 ° C fuktighetskontrollert inkubator. MERK: &#160; Cage kulturer krever en dag eller to av condition for å oppnå konsistente embryo legging mønstre. Drue plater med gjær lime skiftes en gang om morgenen og en gang om kvelde...

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

Den ovennevnte fremgangsmåte beskriver et middel for å oppnå levedyktige Drosophila embryo som er tilgjengelige for små molekyl-behandlinger over et bredt utviklingsområde. Denne metoden introduserer romanen og enkle funn at aldring embryoer ved 18 ° C gjør permeabilization av sent stadium embryo med samme effekt som tidligere bare sett i tidlig stadium embryoer. I tillegg har bruken av far-rødt fargestoff Cy5 karboksylsyre som en permeabilitet indikator vist seg effektive i post-fastsette programmene o...

Drosophila embryo fortsetter å være en ledende modell for undersøkelse av grunnleggende mekanismer for utvikling to. Denne kraftige modellen er støttet av et bredt spekter av molekylærgenetiske verktøy som tillater manipulering av omtrent alle tenke genet til enhver tid punkt, og i løpet av noen utviklings organ. Den lille størrelsen, rask utvikling, og omfattende karakterisering av morfogenese av Drosophila embryo gjør det til en modell av valget for genetiske skjermer, hvorav mange har avdekket grunnleggende utviklingsforløp 3,4. Mange fenotyper i Drosophila embryo har vært preget og er lett tolkbare, ofte gir et middel til å identifisere underliggende molekylære genetiske mekanismene som er ansvarlig for en unormal egenskap. Historisk har en brist på flua embryo modellen vært problemer med å innføre små molekyler til embryonale vev. Denne hindringen har stilt begrensninger på: 1) ossing kjente bioaktive små molekyler som prober for å avhøre utviklingsmessige mekanismer og 2) ved bruk av denne etablerte modellen for å evaluere teratogen eller farmakologisk aktivitet av uncharacterized små molekyler. Som en følge av dette er screening potensialet av flue embryo blitt lite brukt i karakteriseringen av små molekyl-aktivitet. Levering av små molekyler til å fly embryo kan oppnås med to metoder: 1) permeabilization av eggeskallet og 2) mikroinjeksjon. Denne artikkelen presenterer forskudd til metoden ifølge permeabilization som er lett å gjennomføre i innstillingen av en konvensjonell Drosophila laboratorium. Det bør bemerkes at de senere fremskritt innen mikroinjeksjon metoder med MicroFluidics teknologi er også bidrar til fremgangsmåter for å innføre forbindelsene i embryo 5,6. Innføring molekyler til embryoet forhindres av et voksaktig lag av eggeskallet 7. Drosophila eggeskall består av fem lag. Frainnsiden og ut er de: vitelline membran, voksaktig lag, den indre chorionic lag, endochorion og exochorion åtte. De tre ytre lag chorionic kan fjernes ved kort emersion av embryoet i fortynnet blekemiddel, referert til som et trinn dechorionation. Den eksponerte voksaktig sjikt kan deretter bli kompromittert ved eksponering mot organiske oppløsningsmidler, slik som heptan og oktan 7,9, rende dechorionated embryo gjennomtrengelig, mens det forblir innkapslet i den underliggende vitelline membran. Men bruk av slike oppløsningsmidler innfører komplikasjoner på grunn av deres toksisitet og vanskeligheten med å regulere deres sterke permeabilizing handling, som begge har sterk negativ effekt på embryoet levedyktighet 9,10. En fremgangsmåte for permeabilization ved hjelp av et preparat betegnes embryo permeabilization løsningsmiddel (EPS) har tidligere blitt beskrevet en. Dette oppløsningsmiddel består av d-limonen og plante-avledede surfaktanter som gjør det løsningsmiddel som misciblE med vannholdige buffere. Den lave toksisitet av d-limonen, og evnen til å fortynne oppløsningsmiddel til ønsket konsentrasjon, har gitt en effektiv metode for å generere permeable embryoer med høy levedyktighet en. Imidlertid er to endogene faktorer fortsatt å bringe begrensninger for anvendelsen. Først embryoer demonstrere heterogenitet i permeabilitet etter EPS behandling, selv når omsorg er tatt for å opprettholde tett utviklings iscenesettelse. For det andre, embryoer eldre enn ca åtte timer har vist seg vanskelig å permeabilize, konsistent med en hardere av eggeskallet som oppstår etter egglegging 11. Beskrevet her er fremskritt i EPS-metoden at: 1) bistå i å identifisere og analysere nesten identisk permeabilized embryoer, selv etter fiksering og farging skritt har blitt henrettet og 2) gjør permeabilization av embryoer på slutten utviklings tidspunkter (&gt; 8 timer, scene 12 år og eldre). Nærmere bestemt anvendelse av en langt-rødt fargestoff,Cy5 karboksylsyre, er beskrevet som fungerer som en permeabilitet indikator, som vedvarer i løpet av utvikling av embryo og etter formaldehydfiksering. I tillegg er det vist at oppdrett embryoer ved 18 ° C opprettholder eggeskallet i en EPS sensitive tilstand, slik at permeabilization av sent stadium embryoer (stadier 12-16). Disse fremskrittene overvinne de tidligere nevnte begrensninger i EPS metodikk. Dette programmet vil derfor gi etterforskere med et middel for å innføre små molekyler av interesse for embryoet på forskjellige utviklings tidspunkter og samtidig opprettholde levedyktighet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

Drosophila embryo har lenge vært en kraftig laboratoriemodell for å belyse molekylære og genetiske mekanismer som styrer utviklingen. Den enkle genetiske manipulasjoner med denne modellen har fortrengt farmakologiske tilnærminger som er vanlig i andre dyremodeller og cellebaserte analyser. Her beskriver vi de siste fremskritt i en protokoll som muliggjør bruk av små molekyler til å utvikle bananflue embryo. Fremgangsmåten detaljer fremgangsmåte for å overvinne den impermeabilitet av eggeskallet og samtidig opprettholde embryo levedyktighet. Eggeskall permeabilization over et bredt spekter av utviklingsstadier er oppnådd ved anvendelse av en tidligere beskrevet d-limonen embryo permeabilization løsningsmiddel (EPS 1) og ved aldring embryoer ved redusert temperatur (18 ° C) forut for behandling. I tillegg er bruken av en far-rødt fargestoff (Cy5) som en permeabilization indikator som er beskrevet, som er kompatibel med nedstrøms applikasjoner som involverer standard røde og grønne fluorescent fargestoffer i levende og faste preparater. Denne protokoll kan anvendes på studier med bioaktive forbindelser til å sondere utviklingsmessige mekanismer samt for studier med sikte på å vurdere teratogen eller farmakologisk aktivitet av uncharacterized små molekyler.

Embryo håndtering enheter er avbildet i figur 1 for å bistå i å visualisere de &quot;hjemmelagde&quot; enheter for manipulasjon i de ovennevnte protokoller. Resultater sett i Figur 2 illustrerer robust effekt av oppdragelse embryoer ved 18 ° C på deres evne til å bli permeabilized av EPS på sene stadier av utviklingen. Denne tilstanden er brukt i protokollen trinn 2.1. Effekten av Cy5 karboksylsyre fargestoff for å avdekke de forskjellige nivåer av permeabilitet typisk sett i ...

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Innføring av små molekyler til utvikling av Drosophila embryo gir store muligheter for karakterisering av biologiske aktivitet av nye forbindelser, legemidler og toksiner, samt for sondering grunnleggende utviklingsforløp. Metoder som er beskrevet her skissere fremgangsmåte som overvinne naturlige barrierer for denne tilnærmingen, utvider nytten av Drosophila embryo-modellen.

En Måte Permeabilization av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo for Analyser av Small Molecule aktivitet

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskala Nuclear Ekstrakter til Funksjonelle analyser av Gene-uttrykk Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening for små-molekyl modulatorer av Inderlige likeretter kaliumkanaler

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...