Name: a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity
Uploaded: 2014-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Beredning av Fly kulturer, Lösningar och Embryo Handling Devices <ol><li> Bered en bur kultur av Drosophila. Placera 500 + parning flugor av den önskade stammen i en population bur försedd med en 10 cm druva-agarplatta och en fläck av jäst pasta. Upprätthålla kultur i en 25 ° C luftfuktighet kontrollerad inkubator. OBS! &#160; Cage kulturer kräver en dag eller två av konditionering för att få konsekventa embryo om mönster. Grape plattor med jäst pasta byts en gång på morgonen och e...

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

Metoden ovan beskriver ett sätt att få livskraftiga Drosophila embryon som är tillgängliga för små molekyler behandlingar över ett brett utvecklings sortiment. Denna metod introducerar nya och enkla konstaterande att åldras embryon vid 18 ° C möjliggör permeabilisering av embryon sent skede med samma effekt som tidigare bara sett i embryon tidigt stadium. Dessutom har användningen av långt röda färgämnet CY5 karboxylsyra som en permeabilitet indikator visat sig effektiv i post-sätta fast och in...

Drosophila embryot fortsätter att vara en ledande modell för undersökning av grundläggande mekanismer för utveckling 2. Denna kraftfulla modellen stöds av ett brett spektrum av molekylära genetiska verktyg som tillåter manipulationer av i huvudsak vilken gen som helst punkt och inom alla utvecklings organ. Den lilla storleken, snabb utveckling, och omfattande karakterisering av morfogenes av Drosophila embryon gör det en modell av val för genetiska skärmar, varav många har upptäckt grundläggande utvecklingsbanor 3,4. Många fenotyper i Drosophila embryot har karakteriserats och är lätt tolkningsbara, ofta ger ett medel för att identifiera bakomliggande molekylära genetiska mekanismer som är ansvariga för en onormal egenskap. Historiskt sett har en brist av flugan embryot modellen varit svårigheten att införa små molekyler till embryonala vävnader. Detta hinder har ställt begränsningar: 1) ossning kända bioaktiva små molekyler som sönder för att förhöra utvecklingsmekanismer och 2) med hjälp av denna etablerade modell för att utvärdera teratogena eller farmakologisk aktivitet av okarakteriserade små molekyler. Som en följd av detta har screening potential flugan embryot varit underutnyttjade i karakterisering av små molekyler aktivitet. Leverans av små molekyler till flyga embryot kan åstadkommas med två metoder: 1) permeabilisering av äggskalet och 2) mikroinjektion. I denna artikel presenteras förskott till metoden för permeabilization som är lätta att utföra i inställningen av en konventionell Drosophila laboratorium. Det bör noteras att den senaste tidens framsteg inom mikroinjektion metoder med mikrofluidik teknik bidrar också till metoder för att införa föreningarna till embryot 5,6. Introduktion av molekyler till embryot förhindras av ett vaxartat skikt av äggskalet 7. Drosophila äggskal består av fem skikt. Fråninifrån och ut är de: vitellinmembranet, det vaxartade skiktet, det inre chorionic skiktet, endochorion och exochorion 8. De tre yttre chorionic skikt kan avlägsnas genom kortvarig emersion av embryot i utspädd blekmedel, avses ett steg till så dechorionation. Den exponerade vaxartat skikt kan sedan äventyras genom exponering för organiska lösningsmedel, såsom heptan och oktan 7,9, rendering dechorionated embryo genomsläpplig, medan det fortfarande är innesluten i den underliggande vitellinmembranet. Men användningen av dessa lösningsmedel introducerar komplikationer på grund av deras giftighet och svårigheten att reglera sina starka permeabilisering handling, som båda har skarp negativa effekter på embryo bärkraft 9,10. Förfarande för permeabilisering med användning av en komposition benämnd embryo permeabilization lösningsmedel (EPS) har tidigare beskrivits 1. Detta lösningsmedel består av d-limonen och växt-härledda ytaktiva ämnen som gör att det lösningsmedel som skall miscible med vattenbaserade buffertar. Den låga toxiciteten av d-limonen och förmåga att späda ut lösningsmedlet för att önskade koncentrationer som gav en effektiv metod för att generera permeabla embryon med hög viabilitet 1. Däremot har två endogena faktorer fortsatte att föra begränsningar till ansökan. Först, embryon visar heterogenitet i permeabilitet efter EPS behandling, även om försiktighet vidtas för att upprätthålla ett nära utvecklings iscensättning. För det andra, embryon äldre än cirka åtta timmar har visat sig svårt att permeabilize, i linje med en härdning av äggskal som inträffar efter äggläggningen 11. Beskrivs här är framsteg i EPS-metoden som: 1) hjälpa till att identifiera och analysera nästan identiskt permeabilized embryon, även efter fixering och immunfärgning åtgärder har verkställts och 2) möjliggöra permeabilisering av embryon vid sena utvecklings tidpunkter (&gt; 8 tim, scen 12 och äldre). Närmare bestämt applicering av ett långt rött färgämne,CY5 karboxylsyra, beskrivs som fungerar som en permeabilitet indikator, som kvarstår i embryot under utveckling och efter formaldehydfixering. Dessutom visas att uppfödning av embryon vid 18 ° C upprätthåller äggskal i en EPS känsligt tillstånd, som möjliggör permeabilisering av sena skede embryon (stadier 12-16). Dessa framsteg övervinna de tidigare nämnda begränsningarna för EPS-metodik. Det här programmet kommer därför att ge utredarna med ett medel för att införa små molekyler av intresse för embryot vid tydliga utvecklings tidpunkter med bibehållen lönsamhet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

Drosophila embryot har länge varit en kraftfull laboratoriemodell för att belysa molekylära och genetiska mekanismer som styr utvecklingen. Den enkla genetiska manipulationer med denna modell har ersatt farmakologiska metoder som är vanliga i andra djurmodeller och cell-baserade analyser. Här beskriver vi de senaste framstegen inom ett protokoll som möjliggör tillämpning av små molekyler till utvecklingsfruktflugor embryo. Metoden information steg för att övervinna den ogenomtränglighet av äggskal medan embryoviability upprätthållande. Äggskal permeabilisering över ett brett spektrum av utvecklingsstadier uppnås genom tillämpning av en tidigare beskriven d-limonen embryo permeabilization lösningsmedel (EPS 1) och genom åldrande embryon vid reducerad temperatur (18 ° C) innan behandlingar. Dessutom är användning av ett långt rött färgämne (CY5) som en permeabilization indikator beskrivs, som är kompatibel med tillämpningar nedströms involverar standard röd och grön influensaorescent färgämnen i levande och fasta beredningar. Detta protokoll är tillämpligt på studier med bioaktiva föreningar att söka utvecklingsmekanismer samt för studier som syftar till att utvärdera teratogen eller farmakologisk aktivitet av okarakteriserade små molekyler.

Embryo hanteringsanordningar är avbildade i figur 1 för att hjälpa till att visualisera de &quot;hemgjorda&quot; anordningar för manipulation i ovan nämnda protokoll. Resultaten ses i figur 2 illustrerar robusta effekten av uppfödning embryon vid 18 ° C på deras förmåga att permeabiliseras av EPS i sen utvecklingsfas. Detta villkor tillämpas i protokollet steg 2.1. Effektivitet av Cy5 karboxylsyra färgämne för att avslöja de olika nivåerna av genomtränglighet typiskt se...

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Införande av små molekyler till utvecklings Drosophila embryot erbjuder stora möjligheter för karakterisering av biologisk aktivitet av nya föreningar, läkemedel och gifter liksom för sondering grundläggande utvecklingsvägar. Metoder beskrivs häri beskriva åtgärder som övervinner naturliga hinder för detta tillvägagångssätt, utöka nyttan av Drosophila embryon modellen.

Ett förfarande för Permeabilization av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon för analyser av Small Molecule aktivitet

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit analyser för epileptiska anfall Mutationsformer av Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upprätt Imaging av Drosophila Embryon

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Småmolekylära skärm

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskaliga nukleärextrakt för funktionella analyser av genuttryck maskinerier

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening för små molekyler Modulatorer för aktiv kanaler Likriktare Kalium

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...