Name: development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation
Uploaded: 2014-07-09T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Forfatterne ønsker at takke undersøgelsens deltagere og deres forældre. Vi vil også gerne takke Dr. Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) for at få adgang til hans ELISpot læser, Dr. Lubo Alexandrov til statistisk analyse, og Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois og Martine Caty for sagkyndig teknisk assistance. Støttet af tilskud fra le Fonds d&#39;opération pour les projets de recherche Clinique et d&#39;Evalution des teknologier (CHU Sainte-Justine) til HS og PO, ved la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, og ved leukæmi og lymfom Society of Canada. ISF blev støttet af legater fra La Fondation CHU Sainte-Justine og le Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG var modtageren af ​​stipendier fra Department of Microbiology, Infectiologist &amp; Immunologi, Université de Montréal (Gabriel-Marquis Scholarship) FRQS, og den canadiske Institutes of Health Research (CIHR). NM blev støttet af la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Foundation, og FRQS.

Denne forskning protokol blev godkendt af Institutional Ethics Review Board of CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, hvor undersøgelsen blev gennemført. Informeret samtykke blev søgt og fået fra alle undersøgelsens deltagere, deres forældre eller værger. Alle procedurer udføres på dag 1 og 2 skal udføres under sterile forhold (dvs. under en laminar flow hætte). Standard sikkerhedsprocedurer for håndtering af humant blod, bør overholdes nøje. 1.. Coating platter <...

Ændringer og fejlfinding: IFN-γ-ELISpot-assays er blevet anvendt til at undersøge cellemedierede immunreaktioner rettet mod en række af mikrobielle patogener, herunder human immundefekt virus type 1 (HIV-1) 24,25, hepatitis C-virus (HCV) 26, 27, og Mycobacterium tuberculosis 28,29, bare for at nævne et par stykker. Her beskrev vi udviklingen af ​​en IFN-γ ELISpot assay til måling af cellulær immunitet mod, med håbet om at definere korrelater til VZV specifik immun r...

Uropført i 1989 UCBT stigende grad anvendes som en del af behandlingen af forskellige neoplastiske og nonneoplastic blodsygdomme i børn 1. VZV er en cytopatisk humant alphaherpesvirus som forårsager to forskellige sygdomme, skoldkopper (efter primær infektion) og herpes zoster (efter reaktivering). Efter primær infektion, VZV fortsætter gennem hele livet af værten i læ inden sensoriske nerver af dorsalrodsganglier. En af de mest truende infektiøse komplikationer efter UCBT er forbundet med VZV 2-4. I vores kliniske center i mangel af VZV profylakse den kumulative incidens af VZV sygdom VZV sygdom efter 3 år postUCBT var 46% 2. Hos disse patienter er de novo infektion med eller reaktivering af VZV ofte forbundet med visceral formidling til det centrale nervesystem, lunger og lever 5-7. Som et resultat, acyclovir, valacyclovir eller famciclovir profylakse almindeligvis administreres til UBCT modtagere 8,9. Men denne behandlingsstrategi ikke hensyn til den beskyttende potentiale af VZV-specifikke T-lymfocytter eller kinetikken af ​​rekonstituering af VZV-specifikke T-celle-responser. Potentielle problemer i forbindelse med den stigende anvendelse af langsigtede antiherpetic profylakse omfatter a) patient overbehandling; b) udvikling af antiviral resistens 10,11; og c) forringelse af VZV specifik immun rekonstituering 12,13. Fordi påvisning af funktionelle VZV-specifikke T-lymfocytter korrelerer med tilstedeværelsen af langsigtet beskyttelse fra VZV infektion og forbedret klinisk resultat 4,14,15, overvågning cellemedieret immunrespons rettet mod VZV under transplantationen periode kan resultere i en mere rationel anvendelse af antiviral behandling ved at give læger til at skelne patienter, der vil have gavn af VZV profylakse fra dem, hvis immunsystem er i stand til at styre VZV replikation 4,13. IFN-γ ELISpot analysen er almindeligt anvendt til overvågning celle-medierede immunreaktioner i en række forskellige eksperimentelle systemer og kliniske tilstande. Steder genereres efter spaltning af et kromogent substrat, der genererer et synligt og stabilt bundfald på stedet af reaktionen. Hver enkelt plet derved repræsenterer fodaftryk af en individuel cytokin-producerende celle. IFN-γ-ELISpot ikke kun måler evnen af de enkelte celler ex vivo til at producere IFN-γ som respons på in vitro-stimulering med dertil hørende antigen, men det giver også et estimat af frekvensen af reagerer celler i en given cellepopulation 16,17. Ud over sin høje følsomhed, IFN-γ-ELISpot er ligetil at udføre, hvilket gør dets anvendelse mulig i forbindelse med personlige kliniske protokoller formål at vejlede påbegyndelse eller ophør af antiviral behandling. Proceduren beskrevet nedenfor describes et ELISpot-assay, der er specielt designet til at detektere og måle produktionen af IFN-γ af perifert blod mononukleære celler efter in vitro stimulering med VZV afledte antigener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varicella zoster virus (VZV) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed efter navlestrengsblod transplantation (UCBT). Af denne grund er antiherpetic profylakse administreres systematisk til pædiatriske UCBT modtagerne til at forebygge komplikationer forbundet med VZV infektion, men der er ingen stærk, evidensbaseret konsensus, der definerer sin optimale varighed. Fordi T-celle medieret immunitet er ansvarlig for kontrollen af ​​VZV infektion, vurderer rekonstituering af VZV-specifikke T-celle responser efter UCBT kunne give oplysninger om, hvorvidt profylakse bør opretholdes eller kan ophøre. Til dette formål blev en VZV specifikt gamma interferon (IFN-γ) enzym-linked immunospot (ELISpot) assay udviklet til at karakterisere IFN-γ-produktion af T-lymfocytter som respons på in vitro-stimulering med bestrålede levende svækket VZV-vaccine. Denne analyse giver en hurtig, reproducerbar og følsom måling af VZV specifik cell medieret immunitet er egnet til overvågning af rekonstituering af VZV specifik immunitet i en klinisk indstilling og vurdere immunforsvar til VZV-antigener.

IFN-γ-ELISpot-protokollen beskrevet ovenfor blev udviklet og optimeret i vores laboratorium til måling af størrelsen og kvaliteten af cellemedierede immunreaktioner rettet mod VZV 4. Forskellige kilder til VZV-antigen kan anvendes til stimulering trin. Disse omfatter: a) kommercielt tilgængelig vaskemiddel inaktiverede uddrag fra VZV inficerede Vero-celler 18; b) puljer af overlappende syntetiske peptider fra bestemte VZV kodede proteiner, herunder IE63 15 og ORF4 19; c) l...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Nye generationer af funktionelle assays, såsom gamma-interferon (IFN-γ) ELISpot, som opdager cytokinproduktion på enkelt celle niveau og giver både kvantitativ og kvalitativ karakterisering af T-cellereaktioner kan anvendes til at vurdere cellemedierede immunreaktioner rettet mod varicella zoster virus (VZV).

Udvikling af en IFN-γ ELISpot Assay til Vurdere varicellazostervirus-specifik cellemedieret immunitet Efter navlestrengsblod transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse af<em&gt; Tornerose</em&gt; Artificial og antigen-præsenterende celler til genetisk at modificere T-celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering af precursor B-celle-undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolering, differentiering, og Kvantificering af humant antistof-secernerende B-celler fra Blood: ELISpot som Funktionel Udlæsning af humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Anvendelse af en monocyt Monolayer Assay til Evaluer Fcy receptor-medieret fagocytose

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescensbaseret neuraminidase-inhiberingsassay i vurdering af den følsomhed over influenzavira til neuraminidaseinhibitoren Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...