Name: development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation
Uploaded: 2014-07-09T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Die Autoren möchten die Studienteilnehmer und ihre Eltern zu danken. Wir möchten auch Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) für den Zugang zu seiner ELISpot-Leser, Dr. Lubo Alexandrov für die statistische Analyse danken und Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois und Martine Caty für technische Experten Unterstützung. Unterstützt durch Zuschüsse aus le Fonds d&#39;Opération pour les Projets de recherche et d&#39;Clinique EVAlution des Technologien (CHU Sainte-Justine) an HS und PO, von la Fondation Centre de Cancérologie Charles-Bruneau, und von der Leukemia &amp; Lymphoma Society of Kanada. ISF wurde von Stipendien von la Fondation CHU Sainte-Justine und le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS) unterstützt. AJG war der Empfänger der Stipendien von der Abteilung für Mikrobiologie, Infektiologie und Immunologie, Université de Montréal (Gabriel Marquis-Stipendium), FRQS und die Canadian Institutes of Health Rorschung (CIHR). NM wurde von la Fondation CHU Sainte-Justine, der Cole-Stiftung und FRQS unterstützt.

Das Forschungsprotokoll wurde von der Ethik Institutional Review Board von CHU Sainte-Justine in Montreal, Quebec, Kanada, wo die Studie durchgeführt wurde genehmigt. Informierte Zustimmung wurde gesucht und von allen Studienteilnehmern, deren Eltern oder Erziehungsberechtigten erhalten. Alle Verfahren durchgeführt an den Tagen 1 und 2 müssen unter sterilen Bedingungen (dh unter einem Abzug mit laminarer Strömung) durchgeführt werden. Standard-Sicherheitsvorkehrungen im Umgang mit menschlichem Blut sollte ...

Modifikationen und Fehlerbehebung: IFN-γ ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die zellvermittelte Immunantwort gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich der menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1), 24,25, Hepatitis-C-Virus (HCV) 26 gerichtet zu untersuchen, 27, 28,29 und Mycobacterium tuberculosis, um nur einige zu nennen. Hier beschrieben wir die Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay auf zelluläre Immunität gegen zu messen, mit der Hoffn...

Zuerst im Jahr 1989 durchgeführt wird, UCBT zunehmend als Teil der Behandlung von verschiedenen Tumor nichtneoplastische und Blutkrankheiten bei Kindern von 1 verwendet. VZV ist ein zytopathischen menschlichen Alphaherpesvirus, das zwei verschiedene Krankheiten, Varizellen (nach der Primärinfektion) und Herpes zoster (nach Reaktivierung) verursacht. Nach der Primärinfektion, bleibt VZV während der gesamten Lebensdauer des Host innerhalb sensorischen Nerven der Hinterwurzelganglien geschützt. Eine der bedrohlichsten Infektions Komplikationen nach UCBT mit VZV 4.2 verbunden. In unserem Klinikum, in Ermangelung von VZV-Prophylaxe, die kumulative Inzidenz von VZV-Erkrankung VZV Krankheit nach 3 Jahren postUCBT 46% 2. Bei diesen Patienten ist die de novo-Infektion oder Reaktivierung von VZV oft mit viszeralen Verbreitung des zentralen Nervensystems, der Lunge und der Leber 5-7 verbunden. Als ein Ergebnis, Aciclovir, Valaciclovir oder Famciclovir Prophylaxe wird allgemein UB verwaltetCT-Empfänger 8,9. Allerdings ist diese Behandlungsstrategie berücksichtigt nicht das Schutzpotential von VZV-spezifischen T-Lymphozyten oder die Kinetik der Wiederherstellung der VZV-spezifischen T-Zellreaktionen. Mögliche Probleme mit der expandierenden Verwendung von langfristigen Prophylaxe antiherpetischen verbunden sind, umfassen: a) Patientenübertherapie; b) die Entwicklung von antiviralen Medikamentenresistenz 10,11; und c) Wertminderung von VZV-spezifische Immun Rekonstitution 12,13. Weil Erkennung von Funktions VZV-spezifischen T-Lymphozyten korreliert mit der Anwesenheit von langfristigen Schutz von VZV-Infektion und verbesserte klinische Ergebnis 4,14,15, Monitoring-Zell-vermittelten Immunantwort gegen VZV gerichteten während der Posttransplantationsphase könnte in einer rationelleren Verwendung von antiviralen führen Behandlung, indem Ärzte, Patienten, die von VZV-Prophylaxe profitieren würden, unterscheiden sich von denen, deren Immunsystem ist in der Lage zu kontrollieren VZV-Replikation 4,13. Die IFN-γ ELISPOT-Assay wird häufig für die Überwachung zellvermittelte Immunreaktionen in einer Vielzahl von experimentellen Systemen und klinischen Bedingungen verwendet. Punkte werden durch die Spaltung eines chromogenen Substrat erzeugt, wodurch ein sichtbarer Niederschlag und stabil an der Stelle der Reaktion. Jeder Spot stellt damit den Platzbedarf eines einzelnen Zytokin-produzierenden Zelle. IFN-γ ELISPOT misst nicht nur die Fähigkeit der einzelnen Zellen ex vivo IFN-γ in Antwort auf in vitro-Stimulation mit verwandten Antigen produzieren, sondern es stellt auch eine Abschätzung der Frequenz des reagierenden Zellen in einer gegebenen Zellpopulation 16,17. Zusätzlich zu seiner hohen Empfindlichkeit, IFN-γ ist ELISpot unkompliziert durchzuführen, wodurch ihre Anwendung im Rahmen der personalisierten klinische Protokolle zu lenken Beginn oder nach Absetzen der antiviralen Behandlung richtet möglich. Das Verfahren unter describ detailliertes ein ELISpot Assay, der speziell entwickelt wurde, um durch periphere mononukleare Blutzellen erkennen und messen die Produktion von IFN-γ nach in vitro Stimulation mit VZV-Antigenen abgeleitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varizella-Zoster-Virus (VZV) ist eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität nach Nabelschnurblut-Transplantation (UCBT). Aus diesem Grund wird antiherpetischen Prophylaxe systematisch pädiatrischen UCBT Empfänger verwaltet zu Komplikationen mit VZV-Infektion zu verhindern, aber es gibt keine starken, evidenzbasierten Konsens darüber, dass die optimale Dauer definiert. Da T-Zell-vermittelte Immunität ist für die Kontrolle der VZV-Infektion, die Beurteilung der Rekonstitution von VZV-spezifischen T-Zellreaktionen nach UCBT könnten Hinweise, ob Prophylaxe sollte beibehalten werden oder abgebrochen werden können. Zu diesem Zweck wurde eine VZV-spezifischen Interferon-gamma (IFN-γ), Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assay entwickelt, um die IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten als Antwort auf in vitro-Stimulation mit bestrahlten lebenden abgeschwächten VZV-Vakzine kennzeichnen. Dieser Test bietet eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Messung der VZV-spezifischen cell-vermittelte Immunität für die Überwachung der Wiederherstellung der VZV-spezifischen Immunität in einer klinischen Umgebung und die Bewertung der Immunantwort gegen VZV-Antigene.

Die IFN-γ ELISPOT-Protokoll oben beschrieben entwickelt wurde und in unserem Labor optimiert, um das Ausmaß und die Qualität der zellvermittelten Immunreaktionen gegen VZV 4 gerichtet messen. Verschiedenen Quellen der VZV-Antigen zur Stimulation Schritt verwendet werden. Dazu gehören: a) im Handel erhältlich Waschmittel inaktiviert Auszüge aus VZV-infizierten Vero-Zellen 18; b) Pools von überlappenden synthetischen Peptiden, die aus spezifischen VZV kodierten Proteine, einschließlich IE63 <...

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Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...