Name: development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation
Uploaded: 2014-07-09T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Forfatterne ønsker å takke deltagerne og deres foreldre. Vi vil også gjerne takke Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) for tilgang til hans ELISPOT leser, Dr. Lubo Alexandrov for statistisk analyse, og Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois og Martine Caty for ekspert teknisk assistanse. Støttet med tilskudd fra le Fonds d&#39;opération pour les PROJETS de recherche Clinique et d &#39;evalution des teknologier (CHU Sainte-Justine) til HS og PO, etter la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, og ved leukemi og lymfom Society of Canada. ISF ble støttet av stipend fra la Fondation CHU Sainte-Justine og le Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG var mottaker av stipend fra Institutt for mikrobiologi, Infeksjologi &amp; Immunology, Université de Montréal (Gabriel-Marquis stipend), FRQS, og den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR). NM ble støttet av la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Foundation, og FRQS.

Denne forskningen protokollen ble godkjent av Institutional Etikk Review Board of CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, der studien ble gjennomført. Informert samtykke ble søkt og fått fra alle deltagerne, deres foreldre eller verger. Alle prosedyrer utført på dagene 1 og 2 må utføres under sterile betingelser (dvs. under en laminær strømningshette). Standard sikkerhetsprosedyrer for håndtering av menneskeblod bør følges nøye. En. Coating Plates <ol><li> Perme...

Modifikasjoner og feilsøking: IFN-γ ELISPOT-analyser er blitt brukt til å undersøke celle-mediert immunrespons rettet mot en rekke mikrobielle patogener, inkludert humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) 24,25, hepatitt C virus (HCV) 26, 27, og Mycobacterium tuberculosis 28,29, bare for å nevne noen. Her har vi beskrevet utviklingen av en IFN-γ ELISPOT analyse for å måle cellulær immunitet mot, med håp om å definere korrelerer av VZV spesifikk immun rekonstituering i å...

Urfremført i 1989, er UCBT stadig mer brukt som en del av behandlingen av ulike neoplastiske og nonneoplastic blodsykdommer hos barn en. VZV er en cytopatisk menneskelig alphaherpesvirus som forårsaker to forskjellige sykdommer, varicella (etter primærinfeksjon) og herpes zoster (etter reaktivering). Etter primær infeksjon, vedvarer VZV gjennom hele livet av verten skjermet innenfor sensoriske nerver av ryggnerveknutene. En av de mest truende infeksiøse komplikasjoner etter UCBT er forbundet med VZV 2-4. I vår kliniske senter, i fravær av VZV profylakse, den kumulative forekomsten av VZV sykdom VZV sykdommen på tre år postUCBT var 46% to. I disse pasientene, er de novo infeksjon med eller reaktivering av VZV ofte forbundet med visceral formidling til sentralnervesystemet, lungene og leveren 5-7. Som et resultat, acyclovir, Valacyclovir eller famciclovir profylakse er ofte administrert til UBCT mottakere 8,9. Men denne behandlingsstrategi tar ikke hensyn til et beskyttende potensiale VZV spesifikke T-lymfocytter eller kinetikken av tilberedning av VZV spesifikke T celle responser. Potensielle problemer knyttet til den voksende bruken av langsiktige antiherpetic profylakse inkluderer a) pasient overbehandling; b) utvikling av antiviral medikamentresistens 10,11; og c) nedskrivning av VZV spesifikk immun tilberedning 12,13. For påvisning av funksjonelle VZV spesifikke T-lymfocytter korrelerer med tilstedeværelse av langvarig beskyttelse mot VZV-infeksjon og forbedret klinisk resultat 4,14,15, overvåking celle medierte immunresponser rettet mot VZV under fasen etter transplantasjonen kan resultere i en mer rasjonell bruk av antiviral behandling ved at leger å skille pasienter som vil ha nytte VZV profylakse fra dem som immunsystemet er i stand til å kontrollere VZV replikering 4,13. Den IFN-γ ELISPOT-analysen er mye brukt for overvåkning celle-medierte immunresponser i en rekke eksperimentelle systemer og kliniske tilstander. Flekker er generert som følge av spaltning av et kromogent substrat, å generere et synlig og stabil bunnfall på stedet av reaksjonen. Hver enkelt spot representerer dermed fotavtrykk av en individuell cytokin-produserende celle. IFN-γ ELISPOT måler ikke bare evnen til individuelle celler ex vivo for å produsere IFN-γ som svar på in vitro stimulering med antigen beslektet, men den gir også et estimat av frekvensen for å reagere celler i en gitt cellepopulasjon 16,17. I tillegg til høy følsomhet, er IFN-γ ELISPOT enkel å utføre, noe som gjør dens bruk er mulig i sammenheng med tilpassede kliniske protokoller som tar sikte på å lede start eller stans i antiviral behandling. Fremgangsmåten beskrevet nedenfor describes en ELISPOT analysen som er spesielt utviklet for å oppdage og måle produksjonen av IFN-γ ved perifere mononukleære blodceller etter in vitro stimulering med VZV avledet antigener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varicella zoster virus (VZV) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet etter navlestreng blod transplantasjon (UCBT). Av denne grunn er antiherpetic profylakse administreres systematisk for å pediatriske UCBT mottakere for å forhindre komplikasjoner forbundet med VZV-infeksjon, men det ikke er noen sterke bevis basert konsensus som definerer den optimale varighet. Fordi T-celle mediert immunitet er ansvarlig for kontroll av VZV-infeksjon, vurdere rekonstituering av VZV spesifikke T-celle responser etter UCBT kunne gi indikasjon om hvorvidt profylakse bør opprettholdes, eller kan opphøre. For dette formål ble et VZV spesifikke gamma-interferon (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) analyse utviklet for å karakterisere IFN-γ produksjonen av T-lymfocytter som respons på in vitro stimulering med bestrålt levende svekkede VZV-vaksine. Denne analysen gir en rask, reproduserbar og følsom måling av VZV spesifikk cell mediert immunitet egnet for overvåking av tilberedning av VZV spesifikk immunitet i en klinisk setting og vurdere immunrespons til VZV antigener.

Den IFN-γ ELISPOT protokollen beskrevet ovenfor ble utviklet og optimalisert i vårt laboratorium for å måle størrelsen og kvaliteten av celle-medierte immunresponser rettet mot VZV 4.. Diverse kilder til VZV-antigen kan brukes for stimulering trinn. Disse omfatter: a) kommersielt tilgjengelig vaskemiddel inaktiverte ekstrakter fra VZV-infiserte Vero-celler 18; b) bassenger av overlappende syntetiske peptider fra bestemte VZV kodede proteiner, inkludert IE63 15 og ORF4 19;...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generasjoner av funksjonelle analyser slik som gamma-interferon (IFN-γ) ELISPOT, som registrerer cytokin produksjon på celle-nivået, og gi både kvantitativ og kvalitativ karakterisering av T-celle-responser kan bli brukt for å vurdere celle-medierte immunresponser rettet mot varicella zoster virus (VZV).

Utvikling av en IFN-γ ELISPOT analysen å vurdere varicella-zoster virus-spesifikke Cell-mediert immunitet Etter Umbilical Cord Blood Transplantasjon

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Og kunstig antigenpresenterende celler å genmodifisere T celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av forløper B-celle undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolation, Differensiering, og Kvantifisering av humane antistoff-sekresjon B-celler fra blod: ELISPOT som en funksjonell Avlesning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Bruk av en Monocyte ett lag Assay å evaluere Fcy Receptor-mediert Fagocytose

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserte Neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensavirus til neuraminidase Inhibitor Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...