Name: development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation
Uploaded: 2014-07-09T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Författarna vill tacka studiedeltagarna och deras föräldrar. Vi vill också tacka Dr Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) för att få tillgång till sin ELISpot läsare, Dr Lubo Alexandrov för statistisk analys, och Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois och Martine Caty för sakkunnig teknisk hjälp. Finansierats med bidrag från le Fonds d&#39;opération pour les Projets de Recherche Clinique et d&#39;Evalution des teknik (CHU Sainte-Justine) till HS och PO, av la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, och av leukemi och lymfom Society of Kanada. ISF stöddes av stipendier från la Fondation CHU Sainte-Justine och le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG var mottagare av stipendier från institutionen för mikrobiologi, Infectiology &amp; Immunology, Université de Montréal (Gabriel-Marquis stipendium), FRQS, och den kanadensiska Institutes of Health RORSKNING (CIHR). NM stöddes av la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole stiftelsen, och FRQS.

Denna forskning protokoll godkändes av Institutional etikprövningsnämnden i CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, där studien genomfördes. Informerat samtycke söktes och erhölls från alla studiedeltagare, deras föräldrar eller vårdnadshavare. Alla procedurer utförs på dag 1 och 2 skall utföras under sterila förhållanden (dvs. under ett laminärt flöde huva). Standard säkerhetsrutiner för hantering av mänskligt blod bör följas noga. 1. Beläggning av platt...

Modifikationer och felsökning: IFN-γ ELISPOT-analyser har använts för att undersöka cellförmedlade immunsvar som riktas mot en mångfald patogena mikroorganismer, däribland humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) 24,25, hepatit C-virus (HCV) 26, 27, och Mycobacterium tuberculosis 28,29, bara för att nämna några. Här beskrev vi utvecklingen av en IFN-γ ELISpot analys för att mäta cellulär immunitet mot, med hopp om att definiera korrelat av VZV specifikt immun beredni...

Först utfördes 1989 och är UCBT alltmer används som en del i behandling av olika neoplastiska och icke-neoplastisk blodsjukdomar hos barn 1. VZV är ett cytopatiskt mänsklig alfaherpesvirus som orsakar två olika sjukdomar, varicella (efter primärinfektion) och herpes zoster (efter reaktivering). Efter primärinfektionen, kvarstår VZV under hela livet i värd skyddad inom sensoriska nerver av dorsala rotganglier. En av de mest hotande infektiösa komplikationer efter UCBT förknippas med VZV 2-4. I vår kliniska center, i avsaknad av VZV profylax, den kumulativa incidensen av VZV sjukdom VZV sjukdomen på 3 år postUCBT var 46% 2. Hos dessa patienter är de novo infektion eller reaktivering av VZV ofta förknippade med visceral spridning till centrala nervsystemet, lungor och lever 5-7. Som ett resultat, aciklovir, valacyclovir eller famciklovir profylax är allmänt administreras till UBCT mottagare 8,9. Men denna behandlingsstrategi inte hänsyn till den skyddande potentialen hos VZV-specifika T-lymfocyter eller kinetiken för upplösning av VZV-specifika T-cellsvar. Potentiella problem i samband med den ökade användningen av långsiktiga antiherpetic profylax inkluderar a) patienten överbehandling; b) utveckling av antiviral resistens 10,11; och c) nedskrivningar av VZV specifikt immun beredning 12,13. Eftersom detektering av funktionella VZV specifika T-lymfocyter korrelerar med förekomsten av långsiktigt skydd mot VZV infektion och förbättrat kliniskt resultat 4,14,15, övervaka cellmedierade immunsvar mot VZV under perioden efter kan leda till en mer rationell användning av antivirala behandling genom att möjliggöra läkare för att skilja patienter som skulle ha nytta av VZV profylax från dem vars immunsystem kan styra VZV replikering 4,13. I IFN-γ ELISpot analysen används ofta för övervakning cellmedierade immunsvar i olika experimentella system och kliniska tillstånd. Ställen genereras vid klyvning av ett kromogent substrat, vilket genererar en synlig och stabil fällning vid platsen för reaktionen. Varje enskild plats representerar därmed fotavtryck av en individuell cytokin-producerande celler. IFN-γ ELISpot mäter inte enbart förmågan hos individuella celler ex vivo för att producera IFN-γ som svar på stimulering in vitro med motsvarande antigen, men det ger också en uppskattning av frekvensen för svarande celler i en given cellpopulation 16,17. Förutom sin höga känslighet, är IFN-γ ELISpot enkelt att utföra, vilket gör dess användning möjlig i samband med personlig kliniska protokoll som syftar till att styra initiering eller upphörande av antiviral behandling. Det förfarande som beskrivs nedan som beskriveres en ELISpot analys som är särskilt utformad för att upptäcka och mäta produktionen av IFN-γ från perifera mononukleära blodceller efter in vitro stimulering med VZV härledda antigener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varicella zoster-virus (VZV) är en betydande orsak till morbiditet och mortalitet efter navelsträngsblod transplantation (UCBT). Därför är antiherpetic profylax administreras systematiskt till pediatriska UCBT mottagare för att undvika komplikationer i samband med VZV-infektion, men det finns inga starka, evidensbaserad samsyn som definierar dess optimala behandlingstiden. Eftersom T-cellmedierad immunitet är ansvarig för kontroll av VZV-infektion, bedöma beredning av VZV specifika T-cellsvar efter UCBT skulle kunna ge indikationer om huruvida profylax bör behållas eller kan avbrytas. För detta ändamål har en VZV-specifik gammainterferon (IFN-γ) enzymkopplad immunospot (ELISpot)-analys utvecklades för att karakterisera IFN-γ-produktion genom T-lymfocyter som svar på stimulering in vitro med bestrålade levande försvagat VZV-vaccin. Denna analys ger en snabb, reproducerbar och känslig mätning av VZV specifik cell medierad immunitet lämplig för övervakning av beredning av VZV specifik immunitet i en klinisk miljö och bedöma immunförsvar till VZV-antigen.

Den IFN-γ ELISpot protokoll i detalj ovan har utvecklats och optimerats i vårt laboratorium för att mäta storleken och kvaliteten av cellmedierade immunsvar riktade mot VZV 4. Olika källor av VZV-antigen kan användas för stimulering steget. Dessa inkluderar: a) kommersiellt tillgängliga rengöringsmedel inaktiverade utdrag från VZV infekterade Vero-celler 18; b) pooler av överlappande syntetiska peptider från specifika VZV kodade proteinerna, inklusive IE63 15 och ORF4 19...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-ÃŽÂ³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Nya generationer av funktionella analysmetoder såsom gamma-interferon (IFN-γ) ELISpot, som upptäcker cytokinproduktion på enskild cellnivå och ger både kvantitativ och kvalitativ karakterisering av T-cellsvar kan användas för att bedöma cellmedierade immunsvar mot varicella zoster virus (VZV).

Utveckling av en IFN-γ ELISpot analys för att bedöma varicella zoster-cellmedierad immunitet virusspecifika Efter navelsträngsblod Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT): Kvantifiering av TH-1 cellulära immunsvaret mot mikrobiella antigener

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vidhäftning analys för att studera Leucocyte Rekrytering till Human lever Sinus Endothelium under förhållanden av skjuvspänning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserade neuraminidas Inhibition analys för att bedöma känsligheten hos influensavirus till The neuraminidashämmaren Class of Virushämmande

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...