Name: static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00
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Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars fondos de investigación, y la participación de la NYU Whitehead apoya este trabajo.

1. Revestimiento de la microplaca Wells Nota: El objetivo de este paso es a las superficies de poliestireno capa con la ICAM-1 para servir como ligandos para células T de LFA-1. <ol><li> Preparar las siguientes soluciones: <ol><li> Preparar la solución de recubrimiento mediante la resuspensión recombinante de ICAM-1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) enr...

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Hay varios ensayos para estudiar las señales a la LFA-1 de activación y adhesión de células T 12. La citometría de flujo se utiliza para medir la LFA-1 estados de afinidad en las células vivas utilizando anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a cualquiera de doblado o extendido de LFA-1. Una de las limitaciones de este método es que no tiene en cuenta la avidez de las integrinas. Migración ensayos son herramientas útiles, pero miden la migración, y no la adhesión miserable en un punto ...

Adhesión de los linfocitos T es un proceso fundamental en la respuesta inmune 1. Se requiere para la interacción de células T con células endoteliales decoración de las paredes de los capilares, para el antígeno de células presentadoras de barrido (APC) dentro de los ganglios linfáticos, y para la formación de sinapsis inmunológica (IS) con las células diana 2. Estos requisitos son funcionalmente y cinéticamente distintas. El proceso de la extravasación de linfocitos consiste quimioatracción, laminados, la adhesión firme y la transmigración. La transición de la rueda a la adhesión firme requiere que las células T para responder a una señal de receptor acoplado a proteína G rápidamente. Esta respuesta se obtiene una interacción ligando integrina que ralentiza y detiene la célula de rodaje 3. Un cambio inmediato en la avidez de la integrina medie este proceso. La migración requiere interacciones betweenTcells dinámicas y las células endoteliales con la formación de adherencias en el &#39;front-end&#39; y la rotura de adherencias en la &quot;parte trasera&quot;con un intervalo de aproximadamente un minuto entre la formación y la ruptura 4. El IS forma inminutes, pero debe permanecer intacto durante horas 6. Curiosamente, una molécula de adhesión, la función de los linfocitos miembro de la familia de integrinas antígeno asociado (LFA) - 1, es esencial para todos estos procesos 5. LFA-1 media la adhesión a través de interacciones con varios miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. El ligando más ampliamente estudiado con la mayor afinidad a la LFA-1 es la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1. Linfocitos circulantes no activadas expresan baja afinidad de LFA-1 en la superficie celular, y por lo tanto son incapaces de adherirse a la ICAM-1 recubiertos superficies. LFA-1 afinidad es variable y regulada por varios eventos de señalización tales como la activación de la proteína G de receptores acoplados, la estimulación de citoquinas, y las señales mediadas por receptores de células T (TCR). La forma de alta afinidad resultante de la LFA-1 transmite la activación intracelular al espacio extracelular tediante interacciones con la ICAM-1. Esta vía se denomina dentro-fuera de señalización 7. Del mismo modo, la señalización a través de LFA-1 desde el espacio extracelular se llama fuera-en la señalización. La cascadas de señalización intracelular que participan en el interior-y exterior-en la señalización son un foco importante de la investigación actual. La pequeña GTPasa Rap1 ha surgido recientemente como el componente clave de dentro a fuera de señalización que es común tanto a la ligadura de TCR y la señalización de citoquinas 8. El papel crítico de Rap1 en activación de la integrina se pone de relieve por el descubrimiento de que la sobreexpresión de Rap1 estimula la adhesión dependiente de integrina de las células T, mientras que la adhesión de células T está bloqueada por la expresión de dominante negativo Rap1 9. Estos avances en nuestra comprensión de la regulación de la integrina por Rap1 han llevado a cabo utilizando herramientas vitro. Entre ellos se encuentra el ensayo de adhesión estática se describe aquí. El objetivo general de este método es el estudio de Tadhesividad de células a la ICAM-1 las superficies recubiertas. Más específicamente, se utiliza para medir y cuantificar objetivamente la LFA-1 afinidad hacia sus ligandos contador en células vivas en tiempo real, bajo diferentes condiciones. Esta técnica utiliza pocillos de poliestireno recubiertas con ICAM-1 para imitar las superficies celulares que las células T interaccionan con. Muchos ensayos de adhesión de células T estáticos descritos anteriormente fueron experimentalmente complejo. Estos ensayos a menudo necesarios para las células T que se marcaron radiactivamente, utilizan células corneales bovinas cultivadas para crear una matriz extracelular como el sustrato para la adhesión de las células T, o llamados para no fisiológica estimulación de células T durante una duración prolongada para promover la adhesión de células T 10. El uso de la medición fluorométrica para cuantificar las células T después de la incubación de adherencia es un método más sensible y precisa de la cuantificación en comparación con la citometría de flujo y microscopía, como se utilizan en muchos otros sistemas de ensayo 11. Además, solo microscópicas de célulasIC análisis de la localización de la integrina no permite el análisis amplio, la población basada en la misma forma que la medición fluorométrica. Mientras que la activación de LFA-1 anticuerpos específicos de cada estado están disponibles comercialmente, estos anticuerpos ofrecen baja sensibilidad en relación con el método descrito aquí. La principal ventaja sobre las técnicas alternativas es su simplicidad y la capacidad de examinar múltiples condiciones experimentales simultáneamente. Al considerar este método para una aplicación específica, se debe tener en cuenta que las células T deben ser seleccionados negativamente, recién aisladas, y se etiquetan con un marcador fluorescente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

Se requiere la adhesión de linfocitos T para múltiples funciones de las células T, incluyendo la migración a los sitios de inflamación y formación de sinapsis inmunológica con células presentadoras de antígeno. Células T lograr la adhesión regulada mediante el control de las propiedades adhesivas de las integrinas, una clase de moléculas de adhesión celular que constan de pares de proteínas transmembrana heterodiméricas que interactúan con moléculas diana en las células asociadas o matriz extracelular. El más prominente de la integrina células T es función de los linfocitos antígeno asociado (LFA) -1, compuesto por subunidades αL y β2, cuyo objetivo es la molécula de adhesión intracelular (ICAM) -1. La capacidad de una célula T para controlar la adherencia se deriva de la capacidad de regular los estados de afinidad de las integrinas individuales. Dentro de señalización de salida describe el proceso por el cual las señales dentro de una célula causan los dominios externos de las integrinas para asumir un estado activado. Mucho de nuestro conocimiento de estos complejos fenómenos se basa en mecanicistaLos estudios realizados en simplificación en sistemas de modelos in vitro. El ensayo de adhesión de linfocitos T se describe aquí es una excelente herramienta que permite a las células T para que se adhieran a las moléculas diana, en condiciones estáticas, y luego utiliza un lector de placas de fluorescencia para cuantificar la adhesividad. Este ensayo ha sido útil en la definición de sustancias-estimulador o inhibidor de adhesión que actúan sobre los linfocitos, así como la caracterización de los eventos de señalización implicadas. Aunque se ha descrito aquí para la LFA-1 - ICAM-1 de adhesión mediada; este ensayo puede ser fácilmente adaptado para permitir el estudio de otras interacciones adhesivas (por ejemplo, VLA-4 - fibronectina).

A continuación se muestra un ejemplo de ensayo de adhesión usando células T primarias estimuladas con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD3. Es útil conocer la fluorescencia de las células sin lavar (es decir, la carga total). Células no estimuladas sirven como un control negativo y las células tratadas de PMA son el control positivo para anticuerpos anti-CD3. Las células sembradas en pocillos no recubiertos sirven como un control para la ICAM-1. En un experimento típico, el porcentaje de c?...

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Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

Ensayo de adhesión estática es una herramienta poderosa que se puede utilizar para modelar las interacciones entre los linfocitos T y otros tipos de células. Interacciones se generan mediante la inyección de células T marcadas en pocillos recubiertos con moléculas de adhesión, mientras que un lector de placas se utiliza para cuantificar el número de células adherentes después de lavados de serie.

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

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