Name: a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

Die Autoren danken den Beitrag der Hammond Bay Biologische Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Wir danken auch Dr. Melinda Rahmen des Center for Advanced Microscopy an der Michigan State University für ihre technische Unterstützung bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Diese Studie wird durch Zuschüsse aus dem Great Lakes Kommission für die Fischerei zu YWCD und WML unterstützt.

1. Herstellung der Lösung <ol><li> Auffüllen auf 1 l 10x 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4): Gewicht 26,2 g Natriumphosphat (einbasischen), 115 g Natriumphosphat (dibasisches) und 87,66 g NaCl. Löst in etwa 800 ml destilliertem H 2 O, pH-Einstellung und bringt das Volumen auf 1 l mit destilliertem H 2 O. <ol><li> Stellen Sie 1 L 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4): Nehmen Sie 100 ml 10x PBS, und fügen Sie 900 ml destilliertem H 2 O. </li><li> Stellen Sie 1 L 0...

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	<li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+Michigan.">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li><li>Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+biology+of+adult+lampreys.">The general biology of adult lampreys.</a> The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).</li><li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li><li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li><li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia.">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li><li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+patients&#8217;+outcome+post-Kasai+operation:+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen.">Evaluating patients&#8217; outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li><li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection.">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li><li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia.">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li><li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.,+during+metamorphosis:+I.+Atresia+of+the+bile+ducts.">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li><li>Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey.">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Alarc&#243;n, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+before+and+after+metamorphosis.">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li><li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia.">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li><li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey,+Lethenteron+reissneri.">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li></ol>

Dieses Protokoll wird von einer neuen Methode namens &quot;Klarheit&quot; 12, die intakten Gewebes mit Polyacrylamid vernetzt, um ein nanoporöses Hydrogel zu bilden, und streift die Plasmamembran des Gewebes, um optische Transparenz und Durchlässigkeit zu erreichen makromolekularen dann modifiziert. &quot;CLARITY&quot; können intakte Gewebe Bildgebung von Langstrecken-Projektion und lokale Verdrahtung im Nervensystem. Diese neue Methode kann verwendet werden, um die gesamte Gallensystems in Meerneunauge Le...

Meerneunauge durch drei verschiedene Leben zu entwickeln Stufen 1,2. Larven Meerneunauge (L) verbringen die meiste Zeit in Höhlen benthische Filtrierer. Nachdem man durch sieben metamorphen Phasen der dramatischen Veränderungen in der Morphologie und äußere Umgestaltung in die inneren Organe 3, die daraus resultierenden Jugendliche (JV) geben eine parasitäre Phase, während der sie auf Blut-und Gewebeflüssigkeiten von Host-Fische zu füttern, die Erhöhung der Körpermasse mehr als 100 Mal . Nach 1,0 bis 1,5 years Fütterung auf die Wirtsfische im Meer oder großen Seen, Erwachsene aufhören Fütterung während des Frühjahrs und wandern zum Laichen in die Flüsse und dann sterben 1,2. Während der Metamorphose, verliert das Meerneunauge Leber die Gallenblase und der Gallenwege, eine evolutionäre mutierten Phänotyp, die den menschlichen Säugling Krankheit Gallengangsatresie nachahmt. Infant Gallengangsatresie ist eine seltene pädiatrische Lebererkrankung mit schweren medizinischen Komplikationen 4,5,6,7, 8.9.10, aber die Pathogenese und Ätiologie der Gallengangsatresie sind weitgehend unbekannt 4. Patienten mit Gallengangsatresie sterben innerhalb von zwei Jahren nach der Geburt, wenn ein chirurgischer Eingriff (Kasai-Verfahren) durchgeführt wird 5. Anschließend werden diese Patienten erfordern umfangreiche klinische Behandlung und oft eine Lebertransplantation sechs. Viele Theorien Gallenatresie Etiopathogenese vorgeschlagen worden, wie virale Infektionen, kongenitale Fehlbildungen, Autoimmunerkrankungen und toxischen Insult. Allerdings bleibt der Beitrag der jeweils für die Entwicklung der Gallengangsatresie nicht schlüssig 7,8,9,10. Im Gegensatz zu Kindern, die pathologische Gallengangsatresie leiden, unterziehen Meerneunauge entwicklungs programmiert Gallengangsatresie ohne umfangreiche necroinflammation, Fibrose oder Zirrhose 10. Die Tiere können vorübergehende Cholestase während dieses Prozesses 10 leiden, aber passen sich diesem Entwicklungszustanddurch de novo-Synthese und Sekretion von Gallensäuren im Darm nach der Entwicklungs biliäre Atresie, zusätzlich zu bekannten Mechanismen, wie die Verringerung der Gallensalz-Synthese in der Leber 11. Dieser Entwicklungsprozess in Meerneunauge bietet die einzige bekannte Möglichkeit, das Fortschreiten der Gallengangsatresie zu untersuchen. Eine neu entwickelte Methode namens &quot;Klarheit&quot; ermöglicht hochauflösende Bildgebung in komplexen Nervensystem von Säugetieren durch die Umwandlung intakten Gewebe in einem optisch transparenten nanoporöse Hydrogel-12. Mit Meerneunauge Leber und eine modifizierte CLARITY-Protokoll können intakte Gewebe-Bildgebung der Leber und Gallen Degeneration ganzen Metamorphose dokumentiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7901-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">saponin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L337-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (monobasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>04269-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (dibasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH pellets&#160;</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting tools&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)

Gallengangsatresie ist eine seltene Erkrankung des Kindesalters, mit einem geschätzten 1 in 15000 Frequenz im Südosten der Vereinigten Staaten, sondern in ostasiatischen Ländern häufiger mit einer Frequenz von 1 berichtet in 5000 in Taiwan. Obwohl viel über die Verwaltung der Gallengangsatresie bekannt ist, ist der Pathogenese noch ungeklärt. Das Meerneunauge (Petromyzon marinus) bietet eine einzigartige Gelegenheit, um den Mechanismus und den Verlauf von Gallendegeneration zu untersuchen. Meerneunauge entwickeln sich durch drei verschiedene Lebensphasen: Larven, Parasiten und Erwachsenen. Während des Übergangs von Larven von parasitären Jugend, Meerneunauge Metamorphose zu unterziehen mit dramatischen Sanierung und Umbau in äußere Morphologie und inneren Organen. In der Leber wird die gesamte Gallensystems verloren, einschließlich der Gallenblase und der Gallenwege. Eine neu entwickelte Methode namens &quot;Klarheit&quot; wurde modifiziert, um die gesamte Leber und die Kreuzung mit dem Darm in metamorphen Meerneunauge zu klären. DieProzess der Gallen Degeneration wurde durch Verwendung konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert und Meerneunauge während der Metamorphose zu erkennen. Diese Methode bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Gallengangsatresie in einer einzigartigen Tiermodell zu untersuchen.

Mehrere wichtige Entwicklungsschritte in der Leber-Gallen-System auftreten, während das Meerneunauge Metamorphose. Der Gallengang und die Gallenblase Apoptose und entarteten (Abbildung 1). Kombinieren des modifizierten Klärungsverfahren und Färbung mit Leberzellmarker Cytokeratin 19 (CK19, sowohl Cholangiozyten-und Hepatozyten vor und nach der Metamorphose 13 vorhanden) und anti-apoptotischen Bcl-2-Marker mittels konfokaler Mikroskopie wurde die gesamte Gallensystems entlang der Z-Achse (f...

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A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

Eine neue Methode zur Klärung biliäre Leberdegeneration Visualisieren Während Metamorphosis in Seeneunauge ( Petromyzon marinus)

Meerneunauge verlieren die Gallenblase und der Gallenwege während der Metamorphose, ein Prozess ähnlich dem menschlichen Gallengangsatresie. Eine neue Methode der Fixierung und Klärung (CLARITY) wurde modifiziert, um die Gallenwege mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisieren. Diese Methode bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Gallen Degeneration zu studieren.

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

Research

JoVE Journal

Biology

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

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Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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