Name: a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

Forfatterne erkjenner bidrag av Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi vil også takke Dr. Melinda Frame ved Center for Advanced Mikros ved Michigan State University for hennes teknisk støtte i laserskanning konfokalmikroskopi. Denne studien er støttet med tilskudd fra Great Lakes Fishery Commission til YWCD og WML.

1. Løsning Forberedelse <ol><li> Lag 1 L 10x 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (PBS, pH 7,4): veie 26,2 g natriumfosfat (monobasisk), 115 g natriumfosfat (dibasisk), og 87,66 g NaCl. Løs opp i ca 800 ml destillert H 2 O, justere pH, og bringe volumet opp til en L med destillert H 2 O. <ol><li> Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (pH 7,4): ta 100 ml 10 x PBS, og tilsett 900 ml destillert H-2 O. </li><li> Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (pH 7,4) med 0,...

<ol>
	<li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+Michigan.">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li><li>Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+biology+of+adult+lampreys.">The general biology of adult lampreys.</a> The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).</li><li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li><li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li><li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia.">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li><li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+patients&#8217;+outcome+post-Kasai+operation:+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen.">Evaluating patients&#8217; outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li><li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection.">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li><li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia.">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li><li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.,+during+metamorphosis:+I.+Atresia+of+the+bile+ducts.">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li><li>Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey.">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Alarc&#243;n, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+before+and+after+metamorphosis.">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li><li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia.">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li><li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey,+Lethenteron+reissneri.">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li></ol>

Denne protokollen er modifisert fra en ny metode kalt &quot;klarhet&quot; 12, som kryssbinder intakt vev med polyakrylamid for å danne en nanoporøse hydrogel og deretter strimler bort plasmamembranen av vevet for å oppnå optisk transparens og makromolekylær permeabilitet. &quot;CLARITY&quot; lar intakt-vev avbildning av langtrekkende projeksjon og lokale krets ledningsnett i nervesystemet. Denne nye fremgangsmåte kan anvendes til å visualisere hele gallesystemet i sjø lamprett leveren under metamorfos...

Sea lamprett utvikle seg gjennom tre distinkte livsstadier 1,2. Larve havet lamprett (L) tilbringer mest tid i hulene som bunndyr filter feeders. Etter å ha gått gjennom syv metamorfe stadier av dramatiske endringer i ytre morfologi og omorganisering i indre organer 3, de resulterende yngel (JV) angir en parasittisk stadium der spiser de blod og vevsvæsker fra vertsfisk, øke kroppsmassen mer enn 100 ganger . Etter 1,0 til 1,5 år fôring på vertsfisk i havet eller store innsjøer, voksne opphøre fôring i løpet av den tidlige våren og vandrer ut i elvene for å gyte, og deretter dør 1,2. Under metamorfosen, mister havet lamprett leveren galleblæren og hele galletreet, en evolusjonær mutant fenotype som etterligner den menneskelige spedbarn sykdom biliær atresi. Infant biliær atresi er en sjelden pediatrisk leversykdom med alvorlige medisinske komplikasjoner 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenesen av og årsak til galle atresi er i stor grad ukjent fire. Pasienter med galle atresi dør innen to år etter fødselen med mindre kirurgisk inngrep (Kasai prosedyre) utføres fem. Deretter disse pasientene krever omfattende klinisk ledelse og ofte levertransplantasjon seks. Mange teorier om galle atresi etiopathogenesis har blitt foreslått, for eksempel viral infeksjon, medfødte misdannelser, autoimmun sykdom, og giftige fornærmelse. Men bidraget fra hver til utvikling av galle atresi er fortsatt mangelfulle 7,8,9,10. I motsetning til spedbarn som lider patologisk biliær atresi, gjennomgå havet lamprett utviklingshemmede programmert biliær atresi uten omfattende necroinflammation, fibrose eller cirrhose 10. Dyrene kan lide transient kolestase i løpet av denne prosessen 10, men tilpasser seg dette utviklingstilstandvia de novo syntesen og sekresjon av gallesalter i tarmen etter utviklings biliær atresia, i tillegg til kjente mekanismer som for eksempel reduksjon av gallesalt-syntese i leveren 11. Denne utviklingsprosessen i sjø lamprett gir den eneste kjente mulighet til å undersøke utviklingen av galle atresi. En nyutviklet metode kalt &quot;CLARITY&quot; gir høy oppløsning bildebehandling i komplekse pattedyr nervesystem ved å forvandle intakt vevet inn en optisk gjennomsiktig nanoporøse hydrogel 12. Bruke havet lamprett leveren og en modifisert CLARITY protokoll, kan dokumenteres intakt-vev avbildning av galle degenerasjon gjennom leveren metamorfose.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7901-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">saponin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L337-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (monobasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>04269-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (dibasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH pellets&#160;</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting tools&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)

Biliær atresi er en sjelden sykdom i barndommen, med anslagsvis 1 i 15 000 frekvens i sørøst USA, men mer vanlig i østasiatiske land, med en rapportert frekvens av en i 5000 i Taiwan. Selv om mye er kjent om forvaltningen av galle atresi, er dens patogenesen fortsatt unnvikende. Havet lamprett (Petromyzon marinus) gir en unik mulighet til å undersøke mekanismen og progresjon av galle degenerasjon. Sea lamprett utvikle seg gjennom tre forskjellige livsstadier: larve, parasittiske, og voksne. I overgangen fra larver til parasittiske juvenile, sjø lamprett gjennomgå metamorfose med dramatisk omorganisering og ombygging i ytre morfologi og indre organer. I leveren, er hele gallesystemet tapt, inkludert galleblæren og galle treet. En nyutviklet metode kalt &quot;CLARITY&quot; ble endret for å klargjøre hele leveren og krysset med tarmen i metamorfe havet niøye. Denprosessen med galle degenerasjon ble visualisert og skjelnet under havet lamprett metamorfose ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere biliær atresi i en unik dyremodell.

Flere viktige utviklings hendelser oppstår i hepatobiliært systemet under havet lamprett metamorfose. Den gallegang og galleblæren gjennomgå apoptose og degenerert (Figur 1). Kombinere den modifiserte avklaring metoden og farging med levercelle markør cytokeratin 19 (CK19, til stede i begge cholangiocytes og hepatocytter før og etter metamorfose 13) og anti-apoptotisk markør BCL2 hjelp konfokalmikroskopi, ble hele galle systemet fanget langs Z-aksen ( figur 2), og den ...

Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

En ny Avklaring metode for å visualisere Galle Degeneration Under Liver Metamorphosis i Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)

Sea lamprett mister galleblære og galleganger under metamorfose, en prosess som ligner på menneskets biliær atresi. En ny fiksering og avklaring metode (CLARITY) ble endret for å visualisere hele galletreet ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere galle degenerasjon.

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

Research

JoVE Journal

Biology

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediert Gene knockdown og<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay i voksen hunn<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Mygg

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Bruk av Time Lapse Mikroskopi å visualisere anoxia-indusert suspendert animasjon i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryoer

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere explants å teste for Cell Fate Commitment under embryonal utvikling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Kombinert Immunofluorescence og DNA FISH på 3D bevarte Interphase Nuclei å studere endringer i 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Høy gjennomstrømning Microinjections av Sea Urchin zygoter

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

En metode for utvinning av Pigmenter fra Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Bruke en helmontert immunhistokjemisk metode for å studere innerveringen av galdevegen i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...