Name: a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

Los autores agradecen la contribución de la Estación Biológica de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, Servicio Geológico de EE.UU.. También agradecemos a la Dra. Melinda Frame en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad del Estado de Michigan por su apoyo técnico en la microscopía confocal de barrido láser. Este estudio es apoyado por becas de la Comisión de Pesca de Lagos a YWCD y WML.

1. Preparación de la Solución <ol><li> Hacer 1 L de 10x 0,1 M solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sodio (monobásico), 115 g de fosfato de sodio (dibásico), y 87,66 g de NaCl. Disolver en aproximadamente 800 ml de H 2 O destilada, ajustar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con H2O destilada <ol><li> Hacer 1 L de solución salina tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4): Tomar 100 ml de 10x PBS y añadir 900 ml de H2O destilada </li><li> Hacer...

<ol>
	<li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+Michigan.">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li><li>Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+biology+of+adult+lampreys.">The general biology of adult lampreys.</a> The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).</li><li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li><li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li><li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia.">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li><li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+patients&#8217;+outcome+post-Kasai+operation:+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen.">Evaluating patients&#8217; outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li><li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection.">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li><li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia.">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li><li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.,+during+metamorphosis:+I.+Atresia+of+the+bile+ducts.">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li><li>Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey.">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Alarc&#243;n, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+before+and+after+metamorphosis.">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li><li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia.">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li><li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey,+Lethenteron+reissneri.">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li></ol>

Este protocolo se modificó a partir de un nuevo método llamado &quot;claridad&quot; 12, que se reticula tejido intacto con poliacrilamida para formar un hidrogel nanoporoso, y luego despoja de la membrana plasmática del tejido para conseguir la transparencia óptica y la permeabilidad macromolecular. &quot;CLARIDAD&quot; permite obtener imágenes de los tejidos intactos de proyección de largo alcance y el cableado del circuito local en el sistema nervioso. Este nuevo método se puede utilizar para visuali...

Lamprea de mar desarrollarse a través de tres etapas de la vida distinta 1,2. Lamprea marina larvas (L) pasan la mayor parte de tiempo en madrigueras como filtradores bentónicos. Después de pasar por siete etapas metamórficas de cambios drásticos en la morfología externa y la reorganización de los órganos internos 3, a los juveniles (JV) entran en una etapa parasitaria durante el cual se alimentan de sangre y fluidos de los tejidos del pez hospedador, el aumento de la masa corporal de más de 100 veces . 1.0 del a 1,5 años que se alimentan de los peces de acogida en el mar o grandes lagos, los adultos dejan de alimentación durante el comienzo de la primavera y migran hacia los ríos para desovar y luego mueren 1,2. Durante la metamorfosis, el hígado lamprea de mar pierde la vesícula biliar y el árbol biliar, un fenotipo mutante evolutivo que imita la enfermedad infante humano atresia biliar. Atresia biliar infantil es una enfermedad hepática pediátrica rara con complicaciones médicas graves 4,5,6,7, 8.9.10, sin embargo, la patogenia y etiología de la atresia biliar son en gran parte desconocidos 4. Los pacientes con atresia biliar mueren dentro de los dos años después del nacimiento a menos que la intervención quirúrgica (procedimiento de Kasai) se lleva a cabo 5. Posteriormente, estos pacientes requieren un amplio manejo clínico y, a menudo el trasplante hepático 6. Se han propuesto muchas teorías sobre la etiopatogenia atresia biliar, como la infección viral, malformación congénita, enfermedad autoinmune, y el insulto tóxico. Sin embargo, la contribución de cada uno para el desarrollo de la atresia biliar no son concluyentes 7,8,9,10. A diferencia de los niños que sufren atresia biliar patológica, la lamprea de mar se someten desarrollo programado atresia biliar sin una amplia necroinflamación, fibrosis o cirrosis 10. Los animales pueden sufrir colestasis transitoria durante este proceso 10, pero adaptarse a este trastorno del desarrolloa través de la síntesis de novo y de la secreción de sales biliares en el intestino después de la atresia biliar desarrollo, además de los mecanismos conocidos, tales como la reducción de la síntesis de sales biliares en el hígado 11. Este proceso de desarrollo de la lamprea de mar proporciona la única conocida oportunidad de examinar el progreso de la atresia biliar. Un nuevo método desarrollado la llamada &quot;CLARIDAD&quot; permite obtener imágenes de alta resolución en los sistemas nervioso de mamíferos complejos mediante la transformación de tejido intacto en un hidrogel nanoporoso ópticamente transparente 12. El uso de la lamprea de mar hígado y un protocolo CLARIDAD modificada, las imágenes intactas de tejido de la degeneración biliar puede ser documentado a lo largo de la metamorfosis de hígado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7901-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">saponin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L337-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (monobasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>04269-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (dibasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH pellets&#160;</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting tools&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)

La atresia biliar es una rara enfermedad de la infancia, con un estimado de 1 en 15.000 de frecuencia en el sureste de los Estados Unidos, pero más común en los países del este de Asia, con una frecuencia reportada de 1 en 5000 en Taiwán. Aunque se sabe mucho sobre la gestión de la atresia biliar, su patogenia sigue siendo difícil de alcanzar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) ofrece una oportunidad única para examinar el mecanismo y la progresión de la degeneración biliar. Lamprea de mar se desarrollan a través de tres etapas de la vida distintas: larva, parasitarias y adultos. Durante la transición de larvas a juveniles parasitaria, la lamprea de mar sufren metamorfosis con dramática reorganización y remodelación en la morfología externa y los órganos internos. En el hígado, todo el sistema se pierde biliar, incluyendo la vesícula biliar y el árbol biliar. Un nuevo método desarrollado la llamada &quot;CLARIDAD&quot; se modificó para aclarar todo el hígado y el cruce con el intestino en metamórfica lamprea de mar. Laproceso de degeneración biliar fue visualizado y discernido durante la lamprea de mar metamorfosis mediante el uso de microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la atresia biliar en un modelo animal único.

Varios acontecimientos importantes del desarrollo se producen en el sistema hepatobiliar durante la lamprea de mar metamorfosis. El conducto biliar y la vesícula biliar sufren apoptosis y degenerado (Figura 1). Combinando el método de clarificación modificado y tinción con hígado marcador de células citoqueratina 19 (CK19, presente en ambos cholangiocytes y hepatocitos antes y después de la metamorfosis 13) y Bcl2 marcador anti-apoptótica usando microscopía confocal, todo el sistema ...

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A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

Lamprea de mar pierde la vesícula biliar y los conductos biliares durante la metamorfosis, un proceso similar a la atresia biliar humano. Un nuevo método de fijación y aclaración (CLARITY) se modificó para visualizar todo el árbol biliar mediante microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la degeneración biliar.

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

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