Name: a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

Författarna erkänner bidrag Hammond Bay biologiska station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Vi tackar också Dr Melinda Frame vid Centrum för avancerad mikroskopi vid Michigan State University för sin tekniska support i laserskanning konfokalmikroskopi. Denna studie har finansierats med bidrag från de stora sjöarna fiskerikommissionen till YWCD och WML.

1. Lösning Beredning <ol><li> Gör en L 10x 0,1 M fosfatbuffert-saltlösning (PBS, pH 7,4): Väg upp 26,2 g natriumfosfat (enbasisk), 115 g natriumfosfat (dibasiskt), och 87,66 g NaCl. Lös i ca 800 ml destillerat H 2 O, justera pH och ta upp volymen till 1 liter med destillerat H2O <ol><li> Gör 1 L 0,1 M fosfatbuffertsaltlösning (pH 7,4): Ta 100 ml 10x PBS, och tillsätt 900 ml destillerat H2O </li><li> Gör 1 L 0,1 M fosfatbuffert saltlösning (pH 7,4) med 0,1% Triton X-100: Tag 1...

<ol>
	<li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+Michigan.">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li><li>Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+biology+of+adult+lampreys.">The general biology of adult lampreys.</a> The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).</li><li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li><li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li><li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia.">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li><li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+patients&#8217;+outcome+post-Kasai+operation:+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen.">Evaluating patients&#8217; outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li><li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection.">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li><li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia.">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li><li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.,+during+metamorphosis:+I.+Atresia+of+the+bile+ducts.">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li><li>Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey.">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Alarc&#243;n, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+before+and+after+metamorphosis.">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li><li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia.">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li><li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey,+Lethenteron+reissneri.">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li></ol>

Detta protokoll är modifierad från en ny metod kallad &quot;skärpa&quot; 12, som tvärbinder intakt vävnad med polyakrylamid för att bilda en nanoporös hydrogel, och därefter skalar bort plasmamembranet av vävnaden för att uppnå optisk transparens och makromolekylär permeabilitet. &quot;CLARITY&quot; låter intakta-vävnad avbildning av långväga projektion och lokala krets ledningar i nervsystemet. Denna nya metod kan användas för att visualisera hela gallvägar i havsnejonöga lever under meta...

Havsnejonöga utvecklas genom tre olika levnadsstadier 1,2. Larv havsnejonöga (L) tillbringar mest tid i hålor som bentiska filtrerare. Efter att ha gått igenom sju metamorfa stadier av dramatiska förändringar i yttre morfologi och omorganisation i inre organ 3, de resulterande ungdomar (JV) anger en parasit stadium där de livnär sig på blod och vävnadsvätska från värdfisk, öka kroppsmassan mer än 100 gånger . Efter 1,0-1,5 år livnär sig på värdfisk i havet eller stora sjöar, vuxna upphöra utfodring under den tidiga våren och vandrar in i floder för att leka och sedan dö 1,2. Under metamorfos, förlorar havsnejonöga levern gallblåsan och hela gallan trädet, en evolutionär mutantfenotypen som efterliknar människo spädbarn sjukdomen gallgångsatresi. Infant gallgångsatresi är en sällsynt pediatrisk leversjukdom med allvarliga medicinska komplikationer 4,5,6,7, 8,9,10, men patogenesen och etiologi av gallgångsatresi är till stor del okänt 4. Patienter med gallgångsatresi dör inom två år efter födseln, om inte kirurgiskt ingrepp (Kasai förfarande) utförs 5. Därefter dessa patienter kräver omfattande klinisk ledning och ofta levertransplantation 6. Många teorier om gallgångsatresi etiopatogenesen har föreslagits, såsom virusinfektion, medfödd missbildning, autoimmun sjukdom, och toxiska insult. Emellertid förblir inconclusive 7,8,9,10 bidraget från varje till utvecklingen av biliär atresi. Till skillnad från barn som lider patologisk gallgångsatresi, genomgår havsnejonöga utvecklingsmässigt programmerad gallgångsatresi utan omfattande necroinflammation, fibros eller cirros 10. Djuren kan drabbas av övergående kolestas under denna process 10, men anpassa sig till denna utvecklings tillståndvia de novo-syntes och utsöndring av gallsalter i tarmen efter utvecklings gallgångsatresi, förutom kända mekanismer såsom minskning av gallsalt syntesen i levern 11. Denna utvecklingsprocess i havsnejonöga ger den enda kända möjlighet att undersöka utvecklingen av gallgångsatresi. En nyutvecklad metod som kallas &quot;CLARITY&quot; möjliggör högupplöst avbildning i komplexa däggdjurs nervsystem genom att förvandla intakt vävnad i ett optiskt transparent nanoporösa hydrogel 12. Använda havsnejonöga lever och en modifierad CLARITY-protokoll, kan intakt-vävnad avbildning av galla degeneration dokumenteras genom lever metamorfos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% acrylamide&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2% bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7901-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">saponin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L337-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (monobasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>04269-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate (dibasic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH pellets&#160;</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting tools&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)

Gallgångsatresi är en ovanlig sjukdom i barndomen, med en beräknad 1 i 15.000 frekvens i sydöstra USA, men vanligare i östasiatiska länder, med en rapporterad frekvens av 1 i 5000 i Taiwan. Även om mycket är känt om hanteringen av gallgångsatresi, är dess patogenes fortfarande svårfångad. Den havsnejonöga (Petromyzon marinus) ger en unik möjlighet att undersöka mekanismen och utvecklingen av galla degeneration. Havsnejonöga utvecklas genom tre olika livsstadier: larver, parasitiska, och vuxna. Under övergången från larver till parasit juvenil, havsnejonöga genomgår metamorfos med dramatiska omorganisation och ombyggnad i yttre morfologi och inre organ. I levern är hela gallsystemet förlorad, inklusive gallblåsan och den biliära trädet. En nyutvecklad metod som kallas &quot;CLARITY&quot; har ändrats för att klargöra hela levern och korsningen med tarmen i metamorfa havsnejonöga. Denprocess galla degeneration visualiserades och urskiljas under havsnejonöga metamorfos genom laserskanning konfokalmikroskopi. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera gallgångsatresi i en unik djurmodell.

Flera utvecklings viktiga händelser inträffar i lever och galla under havsnejonöga metamorfos. Gallgången och gallblåsan genomgå apoptos och degenererade (figur 1). Kombinera den modifierade förtydligande metod och färgning med levercellmarkör cytokeratin 19 (CK19, närvarande i båda cholangiocytes och hepatocyter före och efter metamorfos 13) och anti-apoptotiska markör Bcl2 använder konfokalmikroskopi ades hela gallsystemet fångas längs Z-axeln ( Figur 2) och...

Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

En ny Förtydligande metod för att visualisera gallan Degeneration Under Lever Metamorphosis i Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)

Havsnejonöga förlorar gallblåsa och gallgångar under metamorfos, en process som liknar mänsklig gallgångsatresi. En ny fixering och förtydligande metod (CLARITY) modifierades för att visualisera hela gallan trädet med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera gallan degeneration.

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

Research

JoVE Journal

Biology

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: En enkel metod för noggrann Genotypning

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated gene Knockdown och<em&gt; In Vivo</em&gt; Diures Analys hos vuxna kvinnliga<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myggor

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryon

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Explantat att testa Cell Fate engagemang under embryonal utveckling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Kombinerad Immunfluorescens och DNA FISH på 3D bevarade interfaskärnorna att studera förändringar i 3D Nuclear organisation

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Hög genomströmning microinjections av Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

En metod för att extrahera Pigment från Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Användning av en helmonterad immunhistokemisk metod för att studera gallringens innervation i<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Buljongen Microdilution In Vitro Screening: en enkel och snabb metod för att upptäcka nya svampdödande föreningar

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...