Name: establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery
Uploaded: 2014-06-26T14:00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discover

Nous sommes reconnaissants à Léonie de Boer et Bas Zaat (Academic Medical Centre) pour nous fournir le S. epidermidis souche O-47. Nous remercions Rico Bongaarts, Francis Smet et Angela Comas (Union Biometrica) de l&#39;aide et des conseils à la COPAS XL et l&#39;analyse de BioImager VAST. Nous remercions Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, et Laura van Hulst, de gardiennage de poissons, et d&#39;autres collègues de l&#39;Université de Leiden aux discussions utiles. Cette recherche s&#39;inscrit dans le cadre du projet P5.03 IBIZA du programme de l&#39;Institut des matériaux biomédicaux, co-financé par le ministère néerlandais des Affaires économiques la recherche, et du Programme Mix (Smart NWOA_6QY9BM) du ministère néerlandais des Affaires économiques et du Le ministère néerlandais de l&#39;Education, de la Culture et de la Science. Un soutien supplémentaire a été obtenu à partir du projet de l&#39;UE ZF-Santé (FP7-HEALTH-2009-242048), et a été soutenue par RMJ bourse Marie Curie comme chercheur expérimenté dans l&#39;UE initiale de formation du réseau FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR a reçu un financement de l&#39;entreprise commune Initiative médicaments innovants vertu d&#39;un accord de subvention n ° 115337, les ressources qui sont composés de la contribution financière du Programme de l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les sociétés de l&#39;EFPIA en auteurs de contribution.The aimables reconnaître davantage le soutien financier du Fonds de l&#39;Université de Leiden (LUF) pour la robotique et de Cyttron, dans le programme des subventions Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, qui à son tour est soutenu financièrement par l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique pour les installations d&#39;imagerie. L&#39;acquisition du système COPAS a été partiellement financé par la Division de la Terre et sciences de la vie (ALW) avec l&#39;aide financière de l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO, 834.10.004).

1. Souches bactériennes et conditions de croissance <ol><li> Préparer S. epidermidis inoculum <ol><li> Prenez plusieurs colonies individuelles de S. epidermidis souche O-47, contenant un dérivé pWVW189 vecteur d&#39;expression mCherry (De Boer L. non publié) à partir d&#39;un milieu Luria Bertani (LB) gélose additionné de 10 ug / ml de chloramphenicol et de la culture pendant une nuit à 37 ° C dans 25 ml de milieu LB supplémenté avec 10 pg / ml de chloramphenicol à midlog étape. </li><li> Centrifugeuse de 1 ml de la culture à 12 000 g pendant 1 min et ensuite les laver 3 fois avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) à 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Mesurer la densité optique à 600 nm (DO 600), et de diluer la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,3 à 2% (p / v) de polyvinylpyrrolidone 40 (PVP 40) dans du PBS. Remarque: une DO 600 de 0,3 correspond à 1,0 x 10 8 unités formant des colonies / ml (cfu / ml). </li></ol&gt; </li><li> Préparer M. marinum inoculum <ol><li> Prenez plusieurs colonies individuelles de M. marinum souche M ou E11 contenant le vecteur pSMT3-mCherry exprimant de manière stable mCherry 10 à partir d&#39;une plaque de gélose Middlebrook 7H10 à 10% (v / v) d&#39;enrichissement Middlebrook OADC additionné de 50 pg / ml d&#39;hygromycine et culture pendant une nuit à 28 ° C dans 10 ml d&#39; bouillon Middlebrook 7H9 avec 10% (v / v) Middlebrook ADC enrichissement supplémenté avec 50 pg / ml d&#39;hygromycine. </li><li> Centrifugeuse de 1 ml de la culture à 12 000 g pendant 1 min et ensuite le laver 3 fois avec 1 ml de PBS stérile avec 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Mesurer la DO 600, et de diluer la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,3 à 2% (p / v) dans du PBS pvp 40. Remarque: une DO600 de 1 correspond à 1,0 x 10 8 ufc / ml. </li></ol></li></ol> 2. Préparer le poisson zèbre oeufs <ol><li> Placez un maximum de 70 hommes et 50 té femelle sauvagepe poisson zèbre séparément dans la grande cuve de reproduction. Remarque: Placez la femelle dans la partie inférieure de la cuve de grand élevage. </li><li> Retirez le séparateur le lendemain dans la matinée, pour laisser le poisson zèbre commencer la reproduction. </li><li> Collecter les oeufs au fond du récipient de grand élevage par l&#39;intermédiaire du collecteur d&#39;oeufs dans un tube de 50 ml remplie d&#39;eau de l&#39;œuf (60 ug / ml océan instant de sel de mer). </li></ol> 3. Aiguilles d&#39;injection <ol><li> Obtenir disponibles dans le commerce sur mesure aiguilles capillaires de verre avec un diamètre intérieur de 10 um. </li></ol> 4. Plan expérimental de l&#39;injection <ol><li> Faire bouillir 100 ml de 1% (p / v) d&#39;agarose dans l&#39;eau d&#39;œuf, et laisser refroidir jusqu&#39;à environ 40 ° C. Verser agarose dans la plaque de micro-injecteurs automatisé et placer le timbre 1024-bien dans l&#39;agarose. Remarque: La plaque est prêt à utiliser lorsque refroidi. </li><li> Sur la automatisé microinjecteur exploitation logiciel, cliquez sur &quot;Calibrer scène»,puis cliquez sur la grille de bien &#39;1024 &#39;et placer la plaque d&#39;agarose dans le micro-injecteur et calibrer la plaque en cliquant sur l&#39;écran à la position du centre du puits. </li><li> Aller au menu &#39;aiguille »et cliquez sur« support d&#39;aiguille d&#39;étalonnage. </li><li> Remplissez l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pointe de microloader soit avec 10 pi pvp 40 contenant 100 ufc / nl S. epidermidis ou 30 cfu / nl M. marinum, ou l&#39;utilisation pvp 40 que l&#39;injection simulée. </li><li> Placez l&#39;aiguille dans le micro-injecteur automatique et calibrer la position x, y en abaissant ou en déplaçant l&#39;aiguille vers le haut et en cliquant sur l&#39;écran à la position de l&#39;aiguille. Ensuite, calibrer la position z de l&#39;aiguille en cliquant sur l&#39;écran à la position de la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Répartir les oeufs sur la grille d&#39;agarose en utilisant une pipette de transfert en plastique, et éliminer l&#39;eau en excès d&#39;oeuf. Placer la grille d&#39;agarose dans le micro-injecteur automatique. </li><li> Aller à la «Injection menu &#39;et ajuster la «pression d&#39;injection&quot; mise à 200 hPa, le «temps d&#39;injection» 0,2 sec et la «pression de la rémunération» 15 hPa, qui est en corrélation avec 1 nl, dans le menu des paramètres FemtoJet. </li><li> Cliquez sur «Injecter» pour injecter la totalité de la plaque. </li><li> Recueillir les œufs après l&#39;injection en les lavant dans une boîte de Pétri (92 x 16 mm), avec un maximum de 70 embryons par boîte de Pétri, et incuber à 28 ° C. </li></ol> 5. Analyse cytomètre en flux <ol><li> Préparer l&#39;écoulement des particules de grande cytomètre selon les instructions du fabricant et remplir la cuvette d&#39;échantillon et le récipient de liquide de gainage avec de l&#39;eau de l&#39;oeuf. </li><li> Au logiciel d&#39;exploitation, allez dans le menu «PMT» et utilisez les paramètres suivants: 650 V pour le canal &quot;rouge&quot; et 0 V pour le «vert» et canaux «jaunes». Ensuite, allez au menu «Seuils de et utilisez les paramètres suivants: &#39;Optical densité &#39;de signal de seuil: 975 mV (valeur COPAS XL: 50) et le «temps de vol» (TOF) minimum de 320 microsecondes (valeur COPAS XL: 800) afin de réduire l&#39;influence des débris. </li><li> Pour une analyse sans trier les embryons passez à l&#39;étape 5.4, pour l&#39;analyse et le tri des embryons dans une boîte de Pétri passez à l&#39;étape 5.5 ou pour l&#39;analyse et le tri des embryons dans une plaque de 96 puits passez à l&#39;étape 5.6. </li><li> Placer les embryons dans l&#39;échantillon tasse et cliquez sur «Start» pour démarrer l&#39;analyse. Lorsque tous les embryons sont analysés arrêter l&#39;analyse en cliquant sur «stop». Enregistrez les données en cliquant sur «magasin tous». Remarque: Toutes les données sont stockées au format TXT, LMD, DAT, fichiers CSV et BSRT. Suivre le protocole à l&#39;étape 5.7. </li><li> Placer les embryons dans l&#39;échantillon tasse et définir le maximum de 70 embryons par plaque à trier en entrant 70 dans le menu &#39;Trier&#39;. Placez une boîte de Pétri vide sous la trieuse et cliquez sur «Manuel Trier &#39;. Lorsque le di Petri<html> sh est rempli, enregistrer les données en cliquant sur «magasin tous». Remarque: Toutes les données sont stockées au format TXT, LMD, DAT, fichiers CSV et BSRT. Suivre le protocole à l&#39;étape 5.7. </li><li> Placer les embryons dans l&#39;échantillon tasse et définir le maximum de 1 embryon par bien d&#39;être triés en entrant 1 dans le menu &#39;Trier&#39;. Placez une plaque de 96 puits vide dans le support de plaque gauche et cliquez sur «Remplir la plaque&quot;. Lorsque la plaque de 96 puits est rempli, enregistrer les données en cliquant sur «magasin tous». Remarque: Toutes les données sont stockées au format TXT, LMD, DAT, fichiers CSV et BSRT. Suivre le protocole à l&#39;étape 5.7. </li><li> Obtenez le fichier TXT pour traiter les données brutes, utilisez les paramètres de filtrage de données suivantes: «Statut Sélectionnez &#39;: 40, et si vous utilisez le module de tri&#39; Etat de tri». 6 Ensuite, utilisez les numéros à partir du signal de fluorescence totale de la &#39;Red &#39;canal pour calculer la moyenne et l&#39;écart type de la moyenne. Tracer ces ensembles de données dans un bar ou dispersion graphiques. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. traitement de la toxicomanie <ol><li> Analyser et trier à 3 jours après l&#39;injection (dpi), M. marinum embryons infectés en deux groupes égaux en utilisant la grosse particule cytomètre de flux (étape 5.5). Traiter un groupe avec un composé d&#39;intérêt dans son solvant de support et l&#39;autre avec seul solvant support (contrôle). Appliquer des traitements similaires à moquer contrôle injecté à essai pour effets secondaires des antibiotiques. </li><li> Répéter à 4 et 5 dpi l&#39;analyse (étape 5.5) et de rafraîchir l&#39;eau d&#39;œuf ou de l&#39;eau d&#39;œuf contenant le composé. </li></ol> 7. Haute Resolution Imaging <ol><li> Anesthésier les embryons avec 0,02% (p / v) de tampon ester éthylique de l&#39;acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) dans l&#39;eau d&#39;œuf 10 min avant l&#39;analyse. </li><li> Préparer le système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés et la Grande Sampler de particules selon les instructions du fabricant. </li><li> Sélectionnez les images de référence correspondant à l&#39;âge des embryons de la «Imaging - Objet211; Configuration de détection &#39;menu. </li><li> Sélectionnez la quantité de photos et d&#39;orientation à effectuer par le système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés de la &#39;imagerie - de stocker des images automatique&#39; menu. </li><li> Placez une plaque de 96 puits rempli d&#39;embryons (de l&#39;étape 5.6) dans le support de plaque gauche de la Grande particules Sampler, et cliquez sur «Exécuter plaque. </li><li> Quand un embryon est détecté et correctement positionnée; l&#39;image de la tête et la queue séparément avec le CLSM l&#39;aide d&#39;un objectif 10X plaine sèche et assembler les images après l&#39;utilisation de logiciels de traitement d&#39;image. </li></ol>

<ol>
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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS est propriétaire de Life Science Méthodes BV qui produit des instruments utilisés dans cet article.

La méthode à haut débit décrit dans le présent document fournit un pipeline efficace rapide et économique pour dépister nombre élevé d&#39;embryons et larves de poissons avec différents types d&#39;infections. Utilisation de la grande cuve de reproduction au lieu de réservoirs traditionnels simples ou familiales reproduction facilité le contrôle du processus de ponte et la production d&#39;un plus grand nombre d&#39;œufs synchrones. Avec une version améliorée du système de micro-injection automatique 7, il est possible d&#39;injecter jusqu&#39;à 2500 oeufs presque tous dans le même étage de la cellule à l&#39;intérieur de 1 h. Avec ces mises à jour et l&#39;amélioration de logiciel, il est possible d&#39;injecter plus d&#39;œufs qu&#39;auparavant qui peuvent être utilisés pour effectuer de grands écrans de la drogue à la prolifération bactérienne comme à lire. Cependant, cette méthode est encore limité au jaune injection, d&#39;autres voies d&#39;injection, décrits par exemple par Benard et al. (2012) 6, nous l&#39;espérons, être incorporés dans le système de micro-injection automatique dans un proche avenir. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bien que ces méthodes sont étalonnées pour le criblage de poisson zèbre, il serait utile pour les applications avec d&#39;autres espèces de poissons ainsi. Par exemple, la carpe commune a été indiqué d&#39;avoir des avantages pour les écrans de drogue. Comme le poisson-zèbre, ovules et embryons à un stade précoce de la carpe commune sont transparentes mais avec le principal avantage de la taille importante du frai de centaines de milliers d&#39;œufs et de la disponibilité des lignes pures qui offrent un fond génétique plus constante 16. L&#39;analyse de grandes quantités d&#39;embryons infectés se fait avec le grand flux de particules à haut débit cytomètre. Cet appareil peut trier les embryons analysés en plaques à puits multiples ou une boîte de Pétri qui le rend particulièrement adapté pour tester un grand nombre de composés. Si une résolution d&#39;image plus élevée est nécessaire, que la configuration est adaptée de manière à ce que l&#39;écoulement des particules de grande cytomètre technologie peut être utilisée pour le pré-criblage et d&#39;analyser ensuite les échantillons à travers un milieumettre à une résolution plus élevée. Cela peut être fait en utilisant la technologie de contrôle automatisé des vertébrés 17, 18. Ce dispositif peut recueillir automatiquement des embryons vivants ou fixes entre 2 et 7 jours après la fécondation d&#39;une plaque multi-puits ou conteneur de vrac, l&#39;image de 360 ​​° à travers un capillaire en utilisant CLSM ou microscopie stéréo et de disposer à nouveau dans deux conteneurs de vrac permettant le tri manuel des embryons sur la base sur les images microscopiques. Les améliorations futures permettront le tri de l&#39;embryon après l&#39;imagerie dans la plaque à plusieurs puits, rendant ainsi possible de filtrer automatiquement grand nombre d&#39;embryons individuels au fil du temps avec CLSM. En supposant que dans les applications futures du système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés peut également être connecté à l&#39;écoulement de particules à grande cytomètre technologie sans la nécessité de larves de distribution avant en plaques à puits multiples, va conduire à un tri plus avancé. Ce document décrit l&#39;un d&#39;établissementd optimisation d&#39;une installation à haut débit pour étudier S. epidermidis et M. marinum infection comme un modèle pour la découverte de médicaments. Elle montre que le résultat de ces bactéries injectées dans le jaune dépend du stade de développement des œufs au moment de l&#39;injection. Injection de M. marinum E11 à l&#39;étape 16 à 128 de la cellule ou de la souche M à 16-64 stade cellulaire conduit au même schéma que les infections injection dans la veine caudale de 2, 6. Cependant cette configuration n&#39;est pas limitée à la prolifération des bactéries pathogènes seulement. Il a été démontré auparavant qu&#39;il est possible d&#39;injecter de manière robotisée solutions contenant de l&#39;ADN, de l&#39;ARN ou morpholinos pour la transgenèse, sur-expression et le gène knock-down études, respectivement 13. En outre, il a été montré que cette configuration est également utile pour l&#39;étude de la prolifération de cellules cancéreuses et de migration. Par conséquent, cette canalisation présente un procédé polyvalent pour le criblages à haut débit d&#39;une variété de mécanismes de signal dans le contextede l&#39;immunité innée, appliqué aux maladies infectieuses et le développement du cancer. Ces écrans peuvent être combinés à d&#39;autres pour la découverte de médicaments, mais également à l&#39;analyse des effets toxiques possibles des médicaments applicables identifiées.

À ce jour, le poisson zèbre (Danio rerio) a été établie avec succès comme un modèle efficace pour étudier une variété de maladies infectieuses 1. L&#39;embryon de poisson zèbre offre unique dans les possibilités d&#39;imagerie in vivo en raison de leur transparence et le grand nombre de lignes de journaliste transgéniques exprimant des protéines fluorescentes existantes. Cette puissante combinaison permet de suivre différents types de cellules immunitaires dans le temps tout en interagissant avec des agents pathogènes comme Mycobacterium marinum, le plus proche parent de M. la tuberculose 2, ou Staphylococcus epidermidis, le responsable principal de biomatériau infection associée 3-5. Différentes voies d&#39;infection peuvent être utilisés dans embryons de poissons zèbres en fonction des besoins de l&#39;étude 6. L&#39;une de ces voies d&#39;infection est injection jaune des bactéries. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux autres est que le jaune infectile peut être effectuée automatiquement par l&#39;intermédiaire d&#39;injection de robot, ce qui réduit considérablement le temps d&#39;injection et qui permet une grande reproductibilité de l&#39;infection 7, 8. Des travaux antérieurs, en utilisant le poisson zèbre comme un débit élevé dans un système de modèle in vivo pour l&#39;étude de S. epidermidis et M. infection marinum a montré pour réussir 7, 8. Ce système est capable de dépister la progression de la maladie par injection de jaune de robot d&#39;embryons précoces et lecture en utilisant la fluorescence comme mesure de la charge bactérienne. En accord avec cette notion, cette configuration a été optimisé et mis en place un pipeline à haut débit très efficace avec le potentiel de générer un grand nombre d&#39;embryons infectés de façon homogène et suivre la progression de l&#39;infection pendant le temps après le traitement d&#39;un certain nombre de composés. Avec la configuration établie, il est possible de générer jusqu&#39;à 8.000 embryons synchrones à l&#39;écranpour la progression de la maladie, le traitement de cette façon jusqu&#39;à 2500 embryons par heure. Les embryons sont triées en fonction de leur charge bactérienne à l&#39;aide d&#39;un système automatisé, assurant groupes homogènes de larves infectées. En outre, afin de valider la configuration, les effets de référence connus pour empêcher la progression de la tuberculose chez des mammifères ont été testés sur des embryons infectés par M. souche E11 marinum ou la souche plus virulente M 9. Cette étude décrit en détail le pipeline à haut débit qui a été mis en place pour être en mesure de générer un grand nombre d&#39;embryons infectés et l&#39;analyse ultérieure de la progression bactérienne au cours du développement et après traitement avec le composé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Poisson zèbre sont de plus en un outil précieux dans la phase préclinique de projections de découverte de médicaments comme un modèle animal entier avec possibilités de criblage à haut débit. Ils peuvent être utilisés pour combler l&#39;écart entre les essais à base de cellules à des stades précoces et à la validation in vivo dans des modèles mammifères, ce qui réduit, de cette manière, le nombre de composés à l&#39;essai en passant par les modèles beaucoup plus coûteux de rongeurs. Dans cette lumière, dans le présent manuscrit est décrit un nouveau pipeline à haut débit en utilisant le poisson zèbre comme in vivo système modèle pour l&#39;étude de Staphylococcus epidermidis et infection de Mycobacterium marinum. Cette configuration permet la génération et l&#39;analyse d&#39;un grand nombre d&#39;embryons synchrones homogène infectés. En outre, la flexibilité de la canalisation permet à l&#39;utilisateur de mettre en œuvre facilement d&#39;autres plates-formes pour améliorer la résolution de l&#39;analyse en cas de besoin. La combinaison de l&#39;ensemble poisson-zèbre avec te innovant à haut débitchnologies ouvre le domaine du dépistage des drogues et de la découverte de nouvelles possibilités, non seulement en raison de la force de l&#39;aide d&#39;un modèle animal entier mais aussi en raison du grand nombre de lignées transgéniques disponibles qui peuvent être utilisés pour déchiffrer le mode d&#39;action des nouveaux composés.

Les présents résultats montrent que la canalisation à haut débit pour étudier S. epidermidis et M. infection marinum a été mis en place avec succès et que peut être étendu à d&#39;autres modèles d&#39;infection. Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation de la grande cuve de reproduction (figure 1A), basé sur le système publié par Adatto et al. (2011) 11, permet de générer un grand nombre d&#39;œufs synchrones dans des événements uniques offrant un contrôle haute du processus de reproduction. Suivant pour pouvoir injecter grand nombre d&#39;embryons dans un court laps de temps, une version améliorée du système automatisé de micro-injection précédemment développé 7 a été utilisé (figure 1A). Pour évaluer ce qui est le meilleur stade de développement de l&#39;infection par le jaune, les injections avec S. epidermidis et M. marinum ont été effectuées à l&#39;ensemble des différentes étapes entre 1 512 et étage de cellule, conformément à la description faite par Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Injections avec 100 ufc S. epidermidis entre l&#39;étage 16 et 128 cellules à condition que le meilleur modèle d&#39;infection (figure 2). Les bactéries se multiplient à l&#39;intérieur du jaune pendant 3 jours et se propagent dans le corps à partir de 3 et suivants dpi. Exécution d&#39;injections avant le stade 16 cellules conduit à une forte mortalité de 4 ppp, et l&#39;injection après l&#39;étape de la cellule 256 a affiché une croissance principalement bactérienne dans le jaune d&#39;œuf avec presque pas de propagation des bactéries à l&#39;intérieur du corps de l&#39;embryon. La quantification de la charge bactérienne a été réalisée par une analyse de l&#39;intensité de fluorescence à l&#39;aide du cytomètre de flux grosse particule, comme décrit par Veneman et al. (2013) 8 (figure 3). Les observations ont montré que le stade optimal de développement pour l&#39;injection de 30 M. ufc marinum injection est comprise entre 16-128 étage de cellule de la souche E11 (figure 4A) et entre 16 à 64 stade de la cellule avec le M strai plus virulentn (figure 4B). Les embryons injectés à ces stades ont montré une croissance bactérienne à l&#39;intérieur du jaune d&#39;oeuf et la propagation des bactéries à travers l&#39;embryon (figure 7). L&#39;infection par les deux souches à des stades précoces présenté croissance bactérienne généralisée non spécifique conduisant les embryons de mourir après 4 dpi. D&#39;autre part, dans les embryons injectés à des stades ultérieurs de la charge bactérienne a été limitée au jaune. Ensuite, un tri préalable avec grande particule cytomètre de flux (figure 1B) a généré de grands groupes homogènes de poissons infectés à l&#39;exclusion des embryons non ou très infectées (figures 5a et 6a). Après un tri préalable, M. embryons infectés marinum ont été traités avec la rifampicine, un premier médicament antituberculeux ligne. Des études antérieures ont démontré que le traitement avec la rifampicine à une dose de 200 uM réduit efficacement M. infection marinum chez le poisson zèbre 7, 13. Prenant Advantage du grand nombre d&#39;embryons infectés de façon homogène générés avec le haut débit installation, le traitement avec des doses différentes a été effectuée. Les embryons infectés par M. marinum souche M et on traite pendant 48 heures avec 12, 24 et 200 uM de rifampicine ont montré efficace pour réduire l&#39;infection mycobactérienne d&#39;une manière dépendante de la dose (Figure 5B). Compte tenu de la réduction efficace de l&#39;infection en utilisant la rifampicine à une dose de 200 uM de cette concentration a été utilisé pour les expériences ultérieures. En ligne avec le résultat précédent, l&#39;étude de l&#39;évolution de la charge bactérienne à l&#39;aide M. souche marinum E11 une réduction significative de 24 heures et au-delà après traitement avec 200 uM rifampicine a été observée (figure 6B). En outre, si l&#39;imagerie à fort grossissement est nécessaire de ces embryons, ils peuvent être affichés automatiquement dans des plaques à 96 puits (figure 1C), d&#39;où les échantillons peuvent être analysés en utilisantle système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés au Grand particules Sampler monté sur un CLSM. Le système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés au Grand Sampler de particules est un système qui peut être soit monté sur un microscope CLSM ou stéréo. Ce dispositif permet le chargement d&#39;embryons vivants ou fixes à partir d&#39;une plaque de 96 puits ou conteneur pour vrac automatiquement à travers un capillaire de verre, et l&#39;oriente en face de la caméra à l&#39;angle désiré (par exemple, dorsal ou latéral). Images de l&#39;embryon dans toutes les orientations peuvent être faites avec la caméra embarquée ou avec un CLSM externe (figure 7). Les embryons seront par la suite transférées dans le récipient de collecte ou de déchets. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figure 1. Outl expérimental Mainstreamine. A) Les poissons adultes sont mis ensemble pour s&#39;accoupler, les oeufs sont recueillis, alignés dans une plaque d&#39;agarose et injectés. B) Les œufs injectés sont incubées à 28 ° C et seront pré-triés pour le possible traitement de la toxicomanie. C) L&#39;analyse ultérieure par grand particules cytomètre de flux et / ou Grande Sampler / vertébré technologie de contrôle automatisé de particules avec CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figure 2. Mise en place de meilleur stade de cellule pour S. epidermidis jaune d&#39;injection. embryons de poisson zèbre ont été injectés dans le jaune à différents stades de développement de 1 à 512 stade de cellule avec 100 ufc de S. epidermidis. Les embryons injectés entre un 1e stade de 8 cellules a montré la croissance bactérienne dans le jaune et le taux élevé de mortalité de 4 dpi. Les embryons injectés entre 16 et 128 stade cellulaire ont montré une croissance bactérienne dans le jaune et l&#39;intérieur du corps à partir de 3 dpi. Embryons injectés entre l&#39;étape 256 et 512 cellules ont montré beaucoup la croissance des bactéries à l&#39;intérieur du jaune. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figure 3. Quantification de la charge bactérienne en utilisant le flux des particules de grande cytomètre. 100 ufc de S. epidermidis ont été injectés dans le jaune d&#39;embryons de poisson zèbre. A) Jusqu&#39;à 5 dpi, chaque jour, des groupes de 10 embryons ont été homogénéisés et plaqué directement, montrant la croissance exponentielle moyenne basée sur deux répliques biologique (barres d&#39;erreur= SEM). B) Grand flux de particules cytomètre analyse montre le signal de fluorescence moyenne de non-injecté et S. epidermidis injecté embryons. 30-160 embryons par condition ont été analysés (barres d&#39;erreur = SEM), des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives par une ANOVA suivie par post-hoc test de Tukey (P &lt;0,001), ns:. Pas de différences significatives C) Corrélation entre ufc et signal de fluorescence moyenne des groupes de 10 S. epidermidis infecté embryons (barres d&#39;erreur = SEM). Ce chiffre a été modifié depuis Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figure 4. Establishment de la meilleure scène de cellule pour M. marinum jaune injection. embryons de poisson zèbre ont été injectés à tous les différents stades de développement de 1 à 512 stade de cellule avec 30 ufc de M. marinum et M souche E11. A, B) Les embryons injectés 1-8 stade cellulaire a montré semblable d&#39;étalement et de la mortalité avec les deux souches. A) Les embryons injectés entre 16-128 étage de cellule de la souche E11 a montré la formation de granulomes et les infections systémiques, tandis que ceux injectés 256-512 stade cellulaire tenu de la charge bactérienne dans le jaune. B) Les embryons injecté entre 16-64 stade de cellule avec M souche a montré la formation de granulomes comme des structures et l&#39;infection systémique alors que ceux injectés 128-512 stade cellulaire conservé la charge bactérienne dans le jaune . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo: Content-width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figure 5. Traitement de M. marinum infection aiguë avec un médicament anti-tuberculose de première ligne. embryons injecté entre 16-64 stade de cellule avec 30 ufc de M. marinum M souche ont été exécutés par la grande particule cytomètre de flux à 3 dpi être triés en deux groupes après avoir éliminé les non et / ou des embryons très infectées. A) fluorescence d&#39;embryons individuels dans les deux groupes. b) des embryons traités par la rifampicine (RIF ) pendant 48 heures à des doses de 12, 24 et 200 uM ont été analysés à 4 dpi; leur charge bactérienne est réduite de manière significative. C) des profils de COPAS représentatifs des embryons traités avec du DMSO et de la rifampicine à des doses de 12, 24 et 200 uM pendant 24 heures. Charge bactérienne et de la distribution est indiqué par les sommets rouges. La ligne bleue représente le profil de l&#39;élément trié (4 dpf poisson zèbre embryo) par les COPAS. 60-90 embryons par condition ont été analysés. Chaque point de données représente un embryon individuel. Les valeurs sont indiquées en tant que moyenne ± SEM. ns: non significatif différences. Analyse de la signification statistique des différences a été réalisée par un ANOVA suivi par le test posthoc de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figure 6. Traitement de M. infection chronique marinum avec un premier médicament antituberculeux ligne. embryons injecté entre 16-64 stade de cellule avec 30 ufc de M. souche marinum E11 ont été exécutés par le flux des particules de grande cytomètre à 3 dpi être triés en deux groupes après avoir éliminé les non et / ou des embryons très infectées.<html> A) La fluorescence des embryons individuels dans les deux groupes. B) Les embryons traités par la rifampicine (RIF) à 200 uM pendant 4 jours ont été analysés montrant une réduction significative de la charge bactérienne après le 1er jour de traitement. 90 embryons par condition ont été analysés. Les valeurs sont indiquées en tant que moyenne ± SEM. Des lettres différentes indiquent des différences significatives entre les points dans le temps du même traitement. * Indique des différences significatives avec le groupe de contrôle. ns: non significatif différences. L&#39;analyse de la signification statistique des différences a été réalisée par une ANOVA suivie d&#39;un test posthoc de Tukey. (P &lt;0,05). Figure B) a été modifié depuis Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figure 7. Résultat de M. injection de jaune marinum E11 imagée en utilisant la technologie de dépistage des vertébrés automatisé et CLSM. pile de Z confocale (cousu 3 images) d&#39;un 5 dpi FLI1-egfp 14 embryon. A) embryon en direct montrant la prolifération de M. bactéries marinum E11 (en rouge) dans tout le corps. B) fixe 5 dpi fli-egfp embryon montrant M. bactéries marinum E11 (en rouge) dans tout le corps co-localisation avec les leucocytes (bleu clair) détectée par L-plastin immunomarquage 15.

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