Name: assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en CASS Foundation Science and Medicine Grant; (MB); en National Health &amp; Medical Research Council of Australia Prosjekt Grant (KLS, 338 516); og ved den viktorianske regjeringens Operasjonell Infrastruktur Support Program (Australia).

En. Utarbeidelse av celler, Media og reagenser <ol><li> Utarbeidelse av Methylcellulose holdig Medium <ol><li> Oppløs 1,5 g metylcellulose i 100 ml sterilt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (ingen additiver) i en 250 ml kolbe. </li><li> Varm løsningen på lav i en mikrobølgeovn i 5 min; ta vare å unngå å koke over. </li><li> Når methylcellulose pulver er semi-oppløst, tilsett en ren magnetrører og media til å ta volumet til 125 ml. </li><li> Bland, invertsukker, og omrør ved romtemperatur i 1,5 timer, etterfulgt av omrøring ved 4 ° C over natten. </li><li> Fordel løsningen likt i fire 50 ml rør og sentrifuger i 1,5 timer ved 2300 x g. </li><li> Samle klar og svært tyktflytende supernatant (ca. 90-95% av aksje), delmengde i sterile 50 ml rør, og oppbevar ved 4 ° C i inntil tre måneder. </li></ol></li><li> Kultur og merking av celler <ol><li> Oppretthold eggstokkreft cellelinjer i monolayer i en tissue kulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i passende vekstmedium (DMEM for KGN cellene 17 og MCBD110: M199 for OVCA429 og OVCA433 cellelinjer 18) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L -glutamin, og 1% penicillin-streptomycin. </li><li> Oppretthold LP9 humane mesothelial celler i M199: Hams F12-medium inneholdende 15% FBS, 10 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF) og 400 ng / ml hydrokortison, i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Seed celler i kolben ønsket størrelse og vokser til ca 75% konfluens. Høst celler ved trypsinering anvendelse av 0,05% trypsin / EDTA, sentrifugering ved 186 xg i 5 min, og vask cellepelleten to ganger med PBS. </li><li> Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. </li></ol></li><li> Valgfritt Fluorescent Cell Merking Metode <ol><li> Resuspender kreftceller ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10 til 6 celler / ml i 1 ml forvarmet PBS/0.1% BSA. </li><li> Tilsett 2 pl 5 mM stam Cell Trace CSFE-løsning (eller en annen foretrukket celle etikett som holdes tilbake på lang sikt) til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 10 mM og inkuberes ved 37 ° C i 10-15 minutter i et vannbad. </li><li> Stans reaksjonen med 1 ml iskaldt medium inneholdende 10% FBS og re-pellet ved sentrifugering. Resuspender i 10 ml av den passende forvarmet vekstmedium (se trinn 1.2.1). </li><li> Seed celler i en 75 cm 2 filter-avkortet kolbe og kultur ved 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Kontroller celler under et fluorescens-mikroskop for å kontrollere at nivået av fluorescens-merking er tilstrekkelig for detektering. Når cellene når ca 75% confluency, innhøsting og telle som i trinn 1.2.3 og 1.2.4 ovenfor. </li></ol></li></ol> 2. Generering av Spheroids i Methylcellulose <ol><li> Beregn volum av eggstokkreft celler fra del 1 som er nødvendig for sfæroide generasjon (totalt 300.000 celler er nødvendig for hver fulle 96-brønns plate eksperimentet). Neite: hvis du bruker ulike cellelinjer enn presenteres her, kan celletetthet for uniform spheroid generasjon må være optimalisert for hver linje. </li><li> For å beregne fortynning av celler i methylcellulose medier, først trekke fra cellen volumet som kreves (trinn 2,1) fra 15 ml. </li><li> Tilsett 3 ml av methylcellulose stamløsning (for å gjøre 20% methylcellulose slutt) til et volum av kulturmedium som passer for hver cellelinje, lik 15 ml minus cellevolum og bland forsiktig ved å snu. </li><li> Legg 300.000 celler til methylcellulose inneholder medium og blandes grundig ved forsiktig vending. </li><li> Pipetter 150 pl av celle / methylcellulose / media blanding (for totalt 3.000 celler / brønn) til hver brønn i en 96-brønners kulturplate konkav bunn og kultur ved 37 ° C, 5% CO2 i 1-4 dager eller inntil ensartede sfæroider danne (1 sfæroide / brønn er vanligvis observert). </li></ol> Tre. RTCA Cell Invasion Analyser NOTE: Impedans opplesninger er uttrykt som celleindeks (CI), en dimensjonsløs parameter som er en relativ endring i målt celle impedans som representerer celletilstand. For analyse, importere data inn i et regneark, for eksempel Microsoft Excel. <ol><li> Plate Forberedelse <ol><li> Å arbeide i grupper på fire brønner på en gang, tilsett 50 pl matrise (fortynnet 1:10 i serumfritt vekstmedium) til hver brønn i det øvre kammer i en 16-brønns RTCA CIM plate for å sikre at det totale overflateareal dekkes . Fjern 30 mL av matrisen umiddelbart, men sakte, for å kvitte seg med overflødig væske. </li><li> Inkuber platen ved 37 ° C i 4 timer før anvendelse i en vevskultur-inkubator. </li><li> Tilsett 30 pl av serumfritt medium (SFM) som passer for hver kreftcellelinje til det øvre kammer, og 160 ul av mediet med eller uten serum (i henhold til en eksperimentell design) til det nedre kammer. </li><li> Monter CIM plate ved å klikke på den nederste kammer i den øvre kammer og equilibrspiste i en 37 ° C inkubator i 1 time i en vevskultur-inkubator. </li></ol></li><li> Programmere RTCA Instrument <ol><li> Åpne RTCA programmet og velg &quot;Oppsett&quot;-fanen. Marker alle eksperimentelle brønner. </li><li> Høyreklikk på brønner og velg &quot;Slå på brønner &#39;; deretter fylle i eksperimentelle forhold og cellenavn som ønsket. </li><li> For å legge til trinn eller-trinnene til programmet, velg &quot;Schedule&quot; tab og høyreklikk på &quot;Legg til et skritt&quot;. Det første trinnet er en forhåndsprogrammert bakgrunn feie, som automatisk innlemmet i programmet en gang &#39;legge et skritt &quot;er valgt. </li><li> Angi ønskede programbeskrivelser for trinn 2 i RTCA programmet, som vil ta opp avlesninger under etableringen av LP9 monolayer. Legg tidsintervallene mellom impedans opplesninger ved å velge fanen &quot;Intervall&quot; og skriver inn &#39;15 min &#39;. Legg eksperimentell varighet ved å velge &quot;Varighet&quot;-fanen end inn i en tid mellom 12-24 hr. </li><li> For å legge til etterfølgende trinn, velger du &quot;Schedule&quot; tab og høyreklikk på &quot;Legg til et skritt&quot; og skriv inn opplysninger om flere trinn, som ovenfor. Trinn 3 av RTCA programmet vil lede instrumentet å ta målinger under spheroid invasjon; skriv &#39;5 min &quot;under&quot; Intervall &quot;-fanen og &#39;48 hr &#39;under&#39; Varighet &#39;kategorien. </li><li> Velg &#39;Plate&#39; på menylinjen og lagre. </li></ol></li><li> Generering av LP9 med ett lag og måling av Spheroid Invasion <ol><li> Plasser CIM plate i RTCA instrument og åpen program fra trinn 3.2 ovenfor. Før tilsetting celler, velger &#39;kjøre&#39; i menylinjen, og deretter &quot;Start&quot;. En bakgrunn feie vil automatisk bli utført (Trinn 1 i RTCA programvare instruksjoner). </li><li> Fjern CIM plate fra instrumentet følgende bakgrunnen feie og plasser i en vev kultur hette. </li><li> Plate 50,000 LP9 celler suspendert i 160 mL SFM inn i det øvre kammeret av hver CIM plate også. </li><li> Sett platen i RTCA instrument og ta målinger hver 15 min mens LP9 monolayer er å etablere over natten (trinn 2 i RTCA program). </li><li> Slaktekreft sfæroider generert under trinn 2 &#39;Generering av sfæroider i methylcellulose&#39;, ovenfor. <ol><li> Aseptisk, kuttet 1 mm av toppen av en 1 ml pipette spissen og bruke til å forsiktig hente innholdet i hver brønn. Overføring til et sterilt rør. </li><li> Sentrifuger sfæroider ved 120 x g i 8 minutter, og fjerne metylcellulose inneholdende medium ved forsiktig aspirasjon. </li><li> Vask sfæroider to ganger med PBS, sentrifugering ved 120 x g i 8 minutter for å pelletere sfæroider etter hver vask. </li><li> For hver eksperimentell godt, resuspender totalt 10 sfæroider i 160 mL av medium uten FBS. </li><li> Pause RTCA eksperimentet ved å velge &#39;kjøre&#39; fra menylinjen og sjekke &amp;# 8216; Pause &#39;. Fjern CIM plate fra instrumentet, og plasser i en vev kultur hette. Aspirer av media fra hver brønn og erstatte med spheroid inneholder media (10 kuler i 160 mL) eller fersk media for LP9-bare kontrollbrønner. </li></ol></li><li> Returner platen til RTCA instrument. Velg &quot;Kjør&quot; fra menylinjen og sjekk &#39;Abort skritt &quot;. Programmet vil flytte til neste trinn automatisk. For å gjenoppta forsøket, velg &quot;Kjør&quot; fra menylinjen og sjekk &#39;Start / Continue &quot;. Trinn 3 i RTCA programmet vil starte. </li></ol></li><li> Data Analysis <ol><li> For å bestemme nivået på spheroid celle invasivitet, trekker verdiene oppnådd for LP9 monolayer bare fra de enkelte målinger innhentet for eggstokkreft cellelinjer på hver endepunktet. </li><li> For å plotte &#39;sfæroide invasjon&#39;, normalisere alle verdier til det tidspunkt hvor de sfæroider ble tilsatt til platen, ved å setting det tidspunktet til &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008:+GLOBOCAN.">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites:+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research.">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li><li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases:+Biology+and+pathology.">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li><li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium:+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression.">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J Transl Med. 4, 6 (2006).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li><li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin.">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li><li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+confrontation+assay:+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro.">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis.">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Invaderende eggstokkreft celler kommuniserer med en rekke celletyper på overflaten av peritoneum, inkludert adipocytter, fibroblaster og mesothelial celler, og toveiskommunikasjon mellom kreftceller og peritoneal-celler antas å spille viktige roller i å drive den metastatisk prosess 2.. Når mestret, protokollen som beskrevet heri kan lett tilpasses til studiet av disse interaksjonene i peritoneal mikromiljøet, for eksempel, ved tilsetning av eksogene cytokiner, vekstfaktorer eller spesifikke inhibitorer mot øvre eller nedre kamre av CIM plate brønn eller genetisk manipulasjon av kreft eller peritoneale cellelinjer. Videre kan denne fremgangsmåten anvendes med primære eggstokkkreftceller høstet ferskt fra ondartede ascites og / eller primære peritoneale celler for å oppnå direkte innsikt i de regulerende signaler og cellulære interaksjoner som regulerer etableringen av en metastatisk lesjon i bukhulen <sopp&gt; to. Bruk av RTCA instrument for å måle invasiv kapasitet på enkeltceller eller sfæroider tilbyr flere fordeler fremfor konvensjonelle enkelt endepunkt analyser og time-lapse bildeanalyser. Den RTCA instrument måler cellulær invasjon ved definerte intervaller kontinuerlig i løpet av et assay, som kan være flere timer eller dager. Dette gjør det mulig for fastsettelse av endringer i frekvensen av invasjonen over tid, som overvinner begrensningene av enkelt endepunkt analyser. For eksempel undersøke invasjons data fra de ulike kreftcellelinjer med en enkelt endepunkt (figur 2), for eksempel, tre timer, kan ha ført til den feilaktige konklusjonen at KGN og OVCA433 celler var langt mer omfattende enn OVCA429 celler. En annen fordel med denne teknologien er at den RTCA instrument måler endringer i elektrisk impedans. Dette betyr at analyser kan kjøres uten å merke celler med et eksogent middel, som kan ha uønskede effekter på celle phenotype eller funksjon. Dette blir spesielt viktig når en skal studere primær eggstokkreft celler avledet fra maligne ascites, som det er viktig å holde manipulasjoner til et minimum, slik som å unngå å introdusere molekylære og fenotypiske endringer som ikke er reflekterende av deres in vivo natur to. Videre muliggjør bruken av RTCA instrument innsamling av kvantitative data i sann tid, noe som ikke bare unngår tidkrevende analyser forbundet med time-lapse mikroskopi, men også gjør det mulig for den raske bestemmelse av viktige eksperimentelle vinduer for assay optimalisering. Dette er spesielt nyttig når man sammenligner effekten av en rekke faktorer på spheroid invasjon, kan like forskjellige faktorer utøve sine maksimal effekt på forskjellige tidspunkter eller med sterkt forskjellige profiler over tid. Selv om denne protokollen er mottagelig for endringer (for eksempel bruk av ulike ECM matrise, ulike kreftcellelinjer, eller forskjellige mål celvs), om å gjøre dette, er det viktig å merke seg at forskjellige eksperimentelle betingelser må først optimaliseres. For eksempel, før igangsetting studier av sfæroide invasjon, det optimale antall av kreftceller / CIM plate brønnen skal først fastslås ved analyse av celletall titreringer i monolag-kultur. Det optimale antall sfæroider som skal brukes per brønn blir deretter basert på denne analysen. For eksempel, i den aktuelle fremgangsmåte, sfæroider består av omtrent 3000 celler hver når først generert. Hvis innledende celle nummer titreringer tyder på at 30 000 celler i monolayer er optimal for deteksjon i invasjonen analyser, deretter 10 sfæroider legges per CIM plate også. Videre, når gjennomføre ko-kultur eksperimenter er det viktig å undersøke de virkemåter for den &quot;target&quot; cell monolayer separat for å bestemme om disse celler er iboende invasiv, da dette kan forvirre resultatene. I eksempelet vist, er kreft sfæroider belagt på toppen av en LP9 celle Monolayer, med og uten FBS lagt til bunnen samt en chemoattractant. Parallelt blir LP9 celler dyrket alene, under hver behandlingstilstand. Tilsvarende, når man studerer invasiv antall celler og sfæroider, er det også viktig å undersøke deres trekkende kapasitet samt for å skille de to oppførsel (dvs. invasjon krever den proteolytiske nedbrytning av en ECM barriere mens migrasjon ikke). For å gjøre dette, utelater ECM barriere (Trinn 3.1.1 - 3.1.3) og gjennomføre analysen parallelt med ECM barriere på plass. Sistnevnte &#39;invasjon&#39; tiltaket kan rettes til den tidligere &quot;migrasjon&quot; mål, hvis det er ønskelig. Til slutt er det viktig å merke seg at informasjonen oppnådd fra målinger av elektrisk impedans er begrenset i omfang når cellene har invadert inn i bunnkammeret, kan endringer i cellenes hefting, spre og spredning på undersiden av membranen bidrar til endringene i impedans readings. Derfor er denne metode mest informative når det brukes i forbindelse med andre assays av sfæroide celleviabilitet, adhesjon, migrasjon og morfologi for å omfattende vurdere sfæroide celle atferd. For eksempel, ideelt sett, for å fullt ut forstå sfæroide-mesothelial interaksjoner, separate co-kulturer bør også bli fotografert med jevne mellomrom i henhold til standard fasemikros slik at kvalitative vurderinger av spheroid morfologi og helse kan gjøres parallelt med kvantitative RTCA analyser av invasjonen. Hvis den valg merking trinnet utføres, deretter atferd av enkeltkreftceller kan bestemmes under fluorescerende mikroskopi som de disaggregate fra spheroid og samhandle med de umerkede mesothelial celler. En ekstra fordel med fluorescerende merking av kreftceller når co-dyrking med en annen celletype, er at det er mulig å bekrefte at bare kreftcellene har invadert gjennom celle og ECM barrierer. <p class="jove_content"&gt; I sammendraget, representerer denne metoden en høy gjennomstrømning kvantitativ analyse av eggstokkreft spheroid invasjon av mesothelial og ECM barrierer. Gjennom tilførsel av eksogene cytokiner, vekstfaktorer, eller spesifikke hemmere til de øvre eller nedre kammer av CIM plate vel, gjør at denne metoden en rask, fastsettelse av faktorer som regulerer samspillet mellom eggstokkreft sfæroide celler invaderende gjennom mesothelial og matrise barrierer i løpet tid.

Eggstokkreft har høyest dødelighet av alle gynekologisk kreft en. På verdensbasis er det ~ 230 000 tilfeller og over 100 000 dødsfall på grunn av sykdommen hvert år en. De fleste pasienter (&gt; 75%) er diagnostisert etter at kreften allerede har spredning når behandling er ytterligere komplisert ved økt motstand mot kjemoterapi og prognosen er dårlig to. Pasienter med stadium III-IV metastatisk sykdom har 5 års overlevelse på bare 30-40% 3. Dermed er det et presserende behov for en bedre forståelse av de cellulære atferd underliggende eggstokkreft metastasering for effektivt å behandle avansert sykdom. Den aktuelle modellen av ovarial cancer metastase foreslår flere trinn i metastatisk prosess, hvor hver av disse forekommer i en distinkt mikromiljøet hvilke virkninger på tumor oppførsel. Metastasizing eggstokkreft celler i utgangspunktet er utgytt fra den primære svulsten nettstedet og overleve i en nonadherent stat i peritoneal væske som enkeltceller eller tredimensjonale flercellede strukturer, kalt flercellede tilslag eller sfæroider 2,4,5. Celler som ikke danner sfæroider i suspensjonen er mer utsatt for anoikis 2,4,5. Sfæroider fremviser også økt motstand mot kjemoterapeutika, bidrar til restsykdom og påfølgende tilbakefall av kreft 2,4,5. Et annet kritisk punkt i eggstokkreft metastasering er overgangen av aggregater fra frittflytende klynger til etablerte sekundære svulster i bukhinnen og omentum 5,6. Celle-celle og celle-substrat interaksjoner har vært innblandet i aggregatdannelse, overlevelse, og tilslutning til den ekstracellulære matrix (ECM) produsert av mesothelial foring av bukhule 4-11. Som ennå, er disse prosessene dårlig forstått. Å definere de mekanismene som er involvert i formidling av eggstokkreft, kan sfæroider være genererte fra etablerte kreftcellelinjer ved hjelp av ikke-festede kultur metoder, vedlikeholde celler i suspensjon enten ved å legge methylcellulose til kultur media 12,13 eller ved dyrkning celler på lav-festeplater 2,14. Når dyrket på denne måte, eggstokkreft celler montere inn flercellede aggregater eller sfæroider som oppviser tilsvarende cellulære, molekylære og biokjemiske egenskaper til de av tumor aggregater funnet in vivo 2,14. Etter dannelse kan sfæroider blir deretter høstet fra adherente medium og replated mot en rekke faste overflater for ytterligere funksjonelle studier. Dette representerer et fremskritt i forhold til assays i monosjikt kultur, som ikke nøyaktig modell atferd av eggstokkreft celler metastasizing innenfor et ikke-adherente miljø slik som intraperitoneal fluid. Den invasiv kapasitet på kreft sfæroider kan vurderes i tradisjonelle endepunkt analyser i Boyden kamre 2 </sup&gt;, men denne tilnærmingen kan være misvisende, som eggstokkreft celle invasjon er en dynamisk prosess over tid. En fersk sanntid metoden har blitt utviklet ved hjelp av time-lapse video mikroskopi av mesothelial celle avklaring fra invaderende eggstokkreft sfæroider 15,16; derimot, er analyse av tidsintervalldata tidkrevende og kan være subjektiv. Heri, er en rask, kvantitativ metode for å vurdere de invasive atferd av eggstokkreft sfæroider i sanntid beskrevet. For det første ble en spheroid-mesothelial cellemodell etablert som representerer stadium av eggstokkreft metastasering når flercellede sfæroider feste til og invadere peritoneal fôr for å danne sekundære svulster. Deretter metodikk for en Real Time Cell Analyzer (RTCA, se Materialer tabell for bedriftsinformasjon) ble tilpasset til å gjennomføre kvantitative sanntidsmålinger av invasiv kapasitet på ulike eggstokkreft cellelinjer dyrket som sfæroider og testet i denne modellen. I RTCA iinstrument, er cellulære responser måles kontinuerlig i løpet av et assay, uten behov for eksogene etiketter, ved å måle forandringer i elektriske impedans. Spesialdesignet kultur plater har gull belagt mikroelektroder plassert under en mikro membran i skjæringspunktet mellom den øvre og nedre kammer av en to kamret godt (&#39;CIM&#39; plater). Plasseringen av elektrodene i det nedre kammer muliggjør måling av endringer i elektrisk impedanse som celler invaderer gjennom en ECM eller ECM / cellulær barriere. Membranen grensesnittet mellom de to kamre i hver CIM plate brønnen er først belagt med ECM-komponenten av interesse. I den sfæroide-mesothelial cellemodellsystemet, er grenseflaten belagt med et lag av Matrigel (se Materialer for selskapsbord detaljer), for å etterligne den komplekse ECM liggende mesothelial slimhinnen i peritoneum, etterfulgt av et konfluent monolag av human mesothelial &#39; target &#39;celler. Til slutt, pre-formede eggstokkreft sfæroider er annonseded. Eggstokkreft sfæroide celler må aktivt invadere gjennom målcellene lag og matrise for å nå bunnen kammer og endre elektriske impedans målinger. Målceller på egen hånd er også vurdert for å sikre at de ikke invaderer gjennom massesjikt, og er egnet for bruk i denne analysen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Eggstokkreft metastaserer ved Shedding inn i peritoneal væske og sprer seg til distale områder innenfor bukhinnen. Ettlagskulturer ikke nøyaktig modell atferd av kreftceller i et ikke-festede miljø, som kreftceller iboende samle inn flercellede strukturer som bidrar til metastatisk prosessen ved å feste til og invaderer peritoneal fôr for å danne sekundære svulster. For å modellere denne viktige fasen av eggstokkreft metastasering, flercellede aggregater, eller sfæroider, kan genereres fra etablerte eggstokkreft cellelinjer opprettholdes i henhold til ikke-festede forhold. For å etterligne peritoneal mikromiljøet som oppdages av tumorceller in vivo, ble en sfæroide-mesothelial ko-kulturmodellen etablert hvori på forhånd dannet sfæroider som er belagt på toppen av en human mesothelial cellemonosjikt, dannet over en ekstracellulær matriks barriere. Metoder ble deretter utviklet ved hjelp av en real-time celle analysator å gjennomføre kvantitativ realtidsmålinger av invasiv kapasitet på ulike eggstokkreft cellelinjer dyrket som sfæroider. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for den kontinuerlige måling av invasjon over lang tid, noe som har flere fordeler i forhold til tradisjonelle endepunkt assays og mer arbeidskrevende sanntid mikrosbildeanalyser. Kort sagt, gjør denne metoden en rask, fastsettelse av faktorer som regulerer samspillet mellom eggstokkreft sfæroide celler invaderende gjennom mesothelial og matrise barrierer over tid.

Eggstokkreft sfæroider kan genereres fra mange typer av cellelinjer ved å dyrke dem i suspensjon eller ved å høste primære tumorceller fra ondartede ascites 2,14. Her to ovarialcancer cellelinjer, OVCA433 og OVCA429, og en ovarial granulosacelletumor svulst linje, KGN, har blitt brukt til å generere sfæroider (Figur 1a). I denne fremgangsmåten dyrkes cellene i U-bunnet brønner mens suspendert i media som er blitt gjort viskøse ved tilsetning av metylcellulose. Under disse forholdene, mange eggstokkreft celler viser en iboende evne til å aggregere å danne sfæroider 13. Etter over natten kultur suspendert i metylcellulose / media, alle tre cellelinjer dannes kompakte sfæroide strukturer av omtrent 400 til 500 mikrometer i diameter (figur 1A). I mellomtiden er RTCA CIM plate fremstilt, for det første ved å belegge den porøse membranen grensesnitt med matrisen, og deretter et konfluent monolag av humane mesothelial celler (Figur 1b). Så snart dannet, sfæroider blir deretter overført til den preparerte CIM plate. Høstet kreft sfæroider er belagt på toppen av LP9 monolayer og vurderes som beskrevet nedenfor. Bilder under standard fasemikroskopi (eller under fluorescerende mikroskopi, hvis den valg celle merking trinn ble fulgt) av parallelle kulturer blir tatt med jevne mellomrom for å hjelpe til med tolkningen av de RTCA data (figur 1C). Det er informative for å vurdere både basal nivå av invasjon av en kreftcellelinje, så vel som kjemotiltrekkende-indusert invasjon. Vanligvis er basal invasivitet målt ved tilsetning av SFM til både de øvre og nedre kammere. Fullstendig medium (10% FBS) som inneholder flere mulige chemoattractants, er brukt i den nåværende eksempel for å undersøke &#39;chemoattractant-indusert&#39; invasjon (figur 2). Parallelle studier av LP9 mesothelial celler alene bekreftet at disse cellene er minimal ivasive over 2 dager under enten basal eller &#39;kjemoattraktant&#39; induserte tilstander og dermed var en god celletypen som skal brukes i co-kultur analyser med eggstokkreft celler (figur 2A og 2B). I kontrast, eggstokkreft sfæroider som genereres ved hjelp av en hvilken som helst av de tre cellelinjene oppviste evnen til å invadere mot en kjemoattraktant (FBS) (figurene 2A-2C). Den store fordelen med å bruke de RTCA sanntid instrumenter over tradisjonelle endepunkt analyser er at endringer i celle / spheroid atferd kan kvantifiseres over tid. I løpet av 2 dagers analyse ble KGN, OVCA429 og OVCA433 cellelinjer alle oppviste evnen til å invadere mot en kjemoattraktant (angitt ved å øke celleindekser) men lave basalnivåer av invasjon (figur 2C). Cellelinjer utstilt samme nivå av invasjonen, som indikert av de parallelle skråningene av kurvene (figur 2C); imidlertid OVCA429 kurven viste en høyere øvre asymptote,som antydet en høyere maksimal grad av invasjon i forhold til de andre cellelinjer. Videre cellelinjer viste forskjeller i sin tid til utbruddet av invasjonen, med KGN cellene raskt invadere cellen og matrise barrierer og OVCA433 og OVCA429 celler tar 3-5x lenger å invadere, henholdsvis (figur 2D). Viktigere, deres atferd ved utbruddet av invasjonen var ikke prediktiv av deres totale kapasitet for invasjon (Tall 2C og 2D). Dette tyder på forskjellige iboende egenskapene til kreftcellelinjer, men også kan tyde på at ulike faktorer kan regulere tidlige og sene invasive atferd av sfæroider. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1 Spheroid generasjon og modell av eksperimentelle satt opp A:.. Jegmages under fase kontrast mikroskopi av sfæroider forming i methylcellulose / media (øverst) og i matchende cellelinje vokst som en monolayer (nederst) B:. Skjematisk viser RTCA 2 kamret CIM plate godt satt opp, der pre-dannet eggstokkreft sfæroider som er belagt på toppen av et monosjikt på en LP9 mesothelial sjikt / matriks barriere i det øvre kammeret og mediet ± FBS som en kjemoattraktant tilsettes til det nedre kammer. Elektroder under grensesnittet av to kamre tiltaket økende elektrisk impedans som flere celler invadere gjennom barrierene mot det nedre kammeret C:. Bilder av KGN sfæroider på toppen av LP9 monolayer under fase kontrast mikroskopi (til venstre) eller fluorescens mikroskopi (til høyre). Scale barer = 100 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> .. Figur 2 Sanntids eggstokkreft spheroid invasjons data A - B: Representative resultater fra en RTCA invasjon analysen utført med og uten FBS i bunnen kammer av et CIM plate også. KGN celle invasjon er i forhold til LP9 mesothelial celler. Resultater er presentert som gjennomsnitt ± SD Cell indeks fra tredoble brønner på 24-timers endepunktet (A), og over en hel to dagers analyseperiode (B) C - D:. En sammenligning av invasive kapasitet KGN, OVCA429 og OVCA433 celle linjer avbildet over en 24 timers periode (c) og i mer detaljert måte i løpet av en 2,5 timers periode (D).

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Vurdering av Ovarian Cancer Spheroid Vedlegg og invasjon av mesothelial celler i sanntid

Eggstokkreft celle invasjon inn i mesothelial foring av bukhule er en dynamisk prosess over tid. Utnytte en sanntidsanalysator, kan den invasiv kapasitet på eggstokkreft celler i en spheroid-mesothelial celle co-kultur modell kvantifiseres over lengre tidsperioder, og gir innsikt i faktorer som regulerer metastatisk prosess.

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

A Real-time elektrisk impedans Basert teknikk for å måle Invasjonen av Endothelial cellemonoskiktet av kreftceller

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

Spheroid Assay å måle TGF-β-indusert Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller av de tidlige trinnene på eggstokkreft Metastase

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Metode for Innhenting av primær eggstokkreft celler fra solide Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berikelse for kjemoresistent eggstokkreft stamceller fra humane cellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro berikelse for eggstokkreft Tumor-initiere Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensjonale (3D) Tumor Spheroid invasjonen analysen

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...