Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par NIH 1R21NS064412, subvention NSF 1052048 et Jeffress Memorial Trust subvention J-908.

1. Préparation de l&#39;échantillon Remarque: Dans de nombreux cas expériences de perfusion lavent une partie importante de cellules, ce qui peut devenir un problème frustrant. Bien que n&#39;étant pas nécessaire pour toutes les lignées cellulaires, les surfaces de verre de revêtement de couverture avec la poly-L-lysine (ajouter 1,0 ml pour 25 cm 2 de solution à 0,01% de la surface, incuber&gt; 5 min, laver deux fois avec de l&#39;eau de qualité culture cellulaire et sec l...

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	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

Le succès d&#39;expériences d&#39;imagerie dépend de quelques facteurs essentiels. L&#39;un de ces facteurs est l&#39;affinité de capteurs utilisés, comme discuté ci-dessus. Concentration absolue du substrat dans le compartiment sous-cellulaire d&#39;intérêt, toutefois, est souvent inconnue. Par conséquent, nous vous recommandons d&#39;essayer plusieurs capteurs ayant des affinités quinconce pour trouver celui qui fonctionne le mieux dans la condition expérimentale souhaitée. Par exemple, dans notre cas, nou...

Grâce à des progrès remarquables dans les technologies qui permet l&#39;examen du transcriptome et le protéome au niveau cellulaire, il est devenu clair que la biochimie et le flux résultant des métabolites et des ions sont de type cellulaire spécifique hautement. Par exemple, dans le foie de mammifère, de la dégradation séquentielle de la glutamine et de la synthèse sont effectuées simultanément par les cellules et les cellules périportes périveineux respectivement, l&#39;alimentation ammonium dans le cycle de l&#39;urée dans le premier type de cellule, tout en consommant un excès d&#39;ammoniac dans celui-ci 3.1. Dans certains cas, l&#39;hétérogénéité biochimique significatif est détecté, même dans une seule &quot;de type cellulaire&quot; 4, 5. En plus d&#39;une telle spécificité spatiale, les niveaux cellulaires de métabolites et des ions sont très dynamiques (par exemple, des molécules telles que Ca 2 + et nucleotides cycliques de signalisation). Les patrons spatiotemporels de métabolites et des ions jouent souvent un rôle crucial dans la transduction du signal. MSUIVI dynamique cellulaire des métabolites et des ions, cependant, poser défi unique. Dans de nombreux cas, le changement dans les concentrations sont rapide et transitoire, comme en témoigne le cas de molécules de signalisation tels que Ca 2 +, qui se désintègre dans ~ 20 ms dans les épines dendritiques 6. En outre, le cloisonnement des voies biochimiques dans et entre les cellules, il est difficile de quantifier la dynamique des métabolites et des ions en utilisant une extraction et une Chromatographie sur colonne / des techniques de spectrométrie de masse. Capteurs codés génétiquement pour les molécules biologiques sont maintenant largement utilisés en raison de la résolution spatio-temporelle élevée qui permet à l&#39;expérimentateur d&#39;étudier la dynamique moléculaire de courte durée et / ou compartimentées (revue en 7, 8). Ces capteurs codés génétiquement peuvent être grossièrement divisées en deux catégories; capteurs fondés sur l&#39;intensité et des capteurs ratiometic. Capteurs basées sur l&#39;intensité sont généralement constitués d&#39;un domaine de liaison et une grippeorescent protéine (PF), et la liaison au domaine de liaison soluté modifie l&#39;intensité de fluorescence. Capteurs Ratiometic, d&#39;autre part, profitent souvent de transfert d&#39;énergie par résonance Foster (FRET) entre deux points focaux qui fonctionnent comme une paire de FRET. Ces capteurs sont constitués d&#39;un domaine de liaison et deux points focaux, et le soluté de liaison induit le changement de l&#39;efficacité de FRET entre les deux points focaux. Un grand nombre de capteurs pour les métabolites et des ions biologiquement importantes ont été développées dans la dernière décennie, 8, 9. Une des possibilités offertes par excitation de ces capteurs codés génétiquement est leur utilisation dans l&#39;analyse à haute résolution du processus de transport de la membrane, ce qui était jusqu&#39;à présent pas facile à détecter au niveau cellulaire. Capteurs codés génétiquement faciliter l&#39;analyse des mécanismes de transport tels que la spécificité du substrat et de la dépendance au pH 10, 11. De plus, en combinaison avec les res génétiquesources comme la bibliothèque de l&#39;ARNi construit pour des organismes modèles, il est désormais possible d&#39;effectuer des recherches sur le génome entier pour de nouveaux procédés de transport à l&#39;aide de capteurs codés génétiquement. En effet, l&#39;utilisation d&#39;organismes génétiquement codé la sonde à la découverte des transporteurs non définies auparavant dans plusieurs cas 12, 13. Récemment, notre laboratoire a développé une série de capteur à base de FRET pour la glutamine. Nous avons démontré que les niveaux de glutamine cellulaire peuvent être visualisés à l&#39;aide de tels capteurs FRET de glutamine 10. Ces capteurs sont constitués d&#39;un donneur de FRET (mTFP1) inséré dans une protéine bactérienne liant glnH glutamine, et un accepteur de FRET (venus) à l&#39;extrémité C-terminale de glnH (Figure 1). FRET efficacité de ces capteurs diminuer lors de la liaison de la glutamine, ce qui entraîne la diminution du rapport d&#39;intensité accepteur / donneur. Régulation fine des processus de transport de la glutamine est important dans les processus biologiques tels que neurotransmission 14, 15 et le maintien de cycle de l&#39;urée dans le foie 1, 16, 17. Ici, nous montrons la méthodologie de l&#39;analyse des activités de transport de capteurs FRET pour la glutamine, l&#39;aide d&#39;un grand champ microscope à fluorescence set-up. Le but d&#39;expériences montrées ici sont pour détecter les activités de transporteur dans une seule cellule et pour examiner la spécificité de substrat d&#39;un transporteur exprimé de manière transitoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Capteurs codés génétiquement permettent un suivi en temps réel de molécules biologiques à une résolution subcellulaire. Une grande variété de ces capteurs pour des molécules biologiques est devenu disponible dans les 15 dernières années, dont certains est devenu un outil indispensable qui sont utilisés en routine dans de nombreux laboratoires. Une des applications intéressantes de capteurs codés génétiquement est l&#39;utilisation de ces capteurs dans l&#39;étude des processus de transport cellulaires. Propriétés des transporteurs tels que la cinétique et des spécificités de substrat peuvent être étudiés au niveau cellulaire, offrant des possibilités d&#39;analyses spécifiques de type cellulaire des activités de transport. Dans cet article, nous allons démontrer comment la dynamique du transporteur peuvent être observés en utilisant le capteur de glutamine génétiquement codé comme un exemple. Conception expérimentale, les détails techniques des paramètres expérimentaux, et des considérations pour les analyses post-expérimentaux seront discutés.

Temps-cours des expériences typiques sont représentées sur la figure 2. Lors de ces expériences, les capteurs FRET de la glutamine ayant des affinités de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, la figure 2A et 2B) et 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C et D) ont été co-exprimés avec une condition de l&#39;échangeur d&#39;acides aminés ASCT2 18 dans des cellules COS7 10. Afflux de glutamine est détecté en tant que changement de rapports d&#39;intensité de fluores...

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Cet article va vous montrer comment contrôler la dynamique de la glutamine dans les cellules vivantes en utilisant FRET. Capteurs codés génétiquement permettent un suivi en temps réel de molécules biologiques à une résolution subcellulaire. Conception expérimentale, les détails techniques des paramètres expérimentaux, et des considérations pour les analyses post-expérimentaux seront discutées pour les capteurs de glutamine codés génétiquement.

Glutamine Flux Imaging Utilisation de capteurs génétiquement codés

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Ciblage des fibres neuronales Tracts pour la thérapie de Stimulation cérébrale profonde à l’aide de modèles interactifs, spécifiques à un Patient

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...