Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00
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이 작품은 NIH 교부금 1R21NS064412, NSF 교부금 1,052,048 및 제프리스 기념 트러스트 부여 J-908에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비 주 : 많은 경우 관류 실험 초조 문제가 될 수있는 세포의 상당한 부분을 씻어 흘려. 폴리-L-라이신 모든 세포 라인, 코팅 커버 유리 표면에 (표면에 0.01 % 용액의 1.0 ml/25 cm 2를 추가 할 필요는 없습니다 만, 세포 배양 등급 물로 2 회 세척&gt; 5 분을 배양하고, 건조 생물 안전 캐비닛) 세포 접착을 향상시킵니다. 또한, 사용되는 세포주의 바이오 안전성 레벨 (BSL)...

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

영상 실험의 성공은 몇 가지 중요한 요소에 따라 달라집니다. 이러한 요인 중 하나는 전술 한 바와 같이, 사용 된 센서의 궁합이다. 또한 세포 내 구획에서 기판의 절대 농도는, 그러나, 종종 알려지지 않았다. 그러므로 우리는 원하는 실험 조건에 따라 가장 적합한을 찾을 수 있도록 지그재그 친화 여러 센서를 시도하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 우리의 경우에 우리는 1.5μ 함께 글루타민 센서를 ...

때문에 세포 수준에서의 전 사체와 단백체의 검사를 할 수 있습니다 기술의 놀라운 발전으로, 지금은 생화학 및 대사 물질과 이온의 결과 유출이 높은 셀 타입의 특정 분명되고있다. 예를 들어, 포유 동물의 간장에 순차 글루타민 분해 및 합성 후자 1-3에 과량의 암모니아를 소비하면서 전 셀 분류 우레아주기 암모늄 수유 각각 문맥 주위 세포와 perivenous 세포에 의해 동시에 수행된다. 일부의 경우, 상당한 이질성 생화학 심지어 단일 &quot;셀 분류&quot;4, 5에서 검출된다. 이러한 공간적 특이성 이외에, 대사 물질 및 이온의 세포 수준 (예 : 칼슘 2 + 및시 클릭 뉴클레오티드 같은 신호 분자, 예) 매우 동적이다. 대사와 이온의 시공간 패턴은 종종 신호 전달에 중요한 역할을한다. 엠대사와 이온의 세포 역학을 onitoring 그러나, 독특한 도전을 제기. 많은 경우에있어서 농도 변화는 빠른 과도 같은 돌기 쪽이 6 ~ 20 밀리 초 내에 소멸 칼슘 2 +와 같은 신호 전달 분자의 경우에 의해 예시된다. 또한, 세포 내와 사이 생화학 적 경로의 구획화 어려운 추출 및 컬럼 크로마토 그래피 / 질량 분석 기술을 이용하여 대사 물질 및 이온의 역학을 정량화 할 수있다. 생물학적 분자 유전자 인코딩 된 센서가 널리 인해 실험이 단명 및 / 또는 구획 된 분자 역학 연구 할 수있는 높은 시공간 해상도로 사용됩니다 (7에서 검토를, 8). 이들 유전자에 의해 코딩 센서는 크게 2 종류로 나눌 수있다; 강도 기반 센서 및 센서 ratiometic. 강도 기반 센서는 일반적으로 결합 도메인과 독감으로 구성orescent 단백질 (FPS) 및 결합 도메인에 결합하는 용질은 형광 강도를 변경합니다. Ratiometic 센서는 반면에, 종종 FRET 쌍으로서 기능이 FPS 사이 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 활용. 이러한 센서는 결합 도메인과 두 FPS로 구성하고, 바인딩 용질이 FPS 간의 FRET 효율의 변화를 유도한다. 생물학적으로 중요한 대사 물질 및 이온 용 센서의 다수는 지난 십 (8, 9)에서 개발되었다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 센서들에 의해 제공되는 흥미로운 가능성 중 하나는 이전에 세포 수준에서 검출하기 쉽지 않았다 막 수송 과정의 고해상도 분석에서의 사용이다. 유전자에 의해 코딩 센서는 기질 특이성하여 pH 의존성 (10, 11) 등의 반송기구의 분석을 용이하게한다. 또한, 유전 입술과 함께의 RNAi 라이브러리 모델 생물에 대한 생성 ources 같은, 그것은 유전자에 의해 코딩 센서를 사용하여 새로운 전송 프로세스에 대한 게놈 전체 검색을 수행 할 수있게되었습니다. 실제로, 다수의 경우 12, 13 이전에 uncharacterized 수송의 발견에 유전자 인코딩 센서 리드의 사용. 최근에, 우리의 실험실은 글루타민 FRET 기반 센서의 시리즈를 개발했습니다. 우리는 셀룰러 글루타민 농도는 FRET 글루타민 센서 (10)를 이용하여 가시화 될 수 있다는 것을 증명하고있다. 이 센서는 glnH의 C-말단 (그림 1)에서 세균 글루타민 결합 단백질 glnH에 삽입 된 FRET 기증자 (mTFP1) 및 FRET 수용체 (금성)으로 구성되어 있습니다. 이들 센서의 FRET 효율성 셉터 / 도너 강도 비의 감소의 결과로, 글루타민의 결합시 감소. 글루타민 전송 프로세스의 미세 조정은 neurotransm 같은 생물 학적 과정에 중요ission (14), (15) 및 간 1, 16, 17의 우레아주기의 유지. 여기서 우리는 광 시야 형광 현미경 셋업을 사용하여, 글루타민 FRET 센서로 전송 활동을 분석하는 방법을 보여준다. 여기에 도시 된 실험의 목표는 하나의 셀에 수송 활동을 검출하고 일시적으로 발현 트랜스 포터의 기질 특이성을 검토한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 생물학적 분자와 같은 센서의 엄청난 다양성은 많은 실험실에서 일상적으로 사용되는 필수 도구가 된 일부는, 지난 15 년 동안 사용 가능하게되었다. 유전자에 의해 코딩 센서 흥미로운 애플리케이션 중 하나는 셀룰러 전송 프로세스를 조사하고 이러한 센서의 사용이다. 이러한 반응 속도 및 기판 특이성 등의 수송의 속성 수송 활동의 세포 타입 별 분석에 대한 가능성을 제공하는 세포 수준에서 조사 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 수송 역학 예를 들어 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서를 사용하여 관찰 할 수있는 방법을 보여줍니다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석에 대한 고려 사항이 논의 될 것이다.

전형적인 시간 코스 실험 그림 2에 표시됩니다.이 실험에서, 8 개 mm (FLIPQTV3.0_8m, 그림 2A와 2B) 및 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C 및 D)의 친화력과 글루타민 센서를 FRET와 공동으로 표현했다 COS7 세포 (10)의 필수 아미노산 교환기 ASCT2 18. 글루타민의 유입은 도너 (mTFP1) 및 억 셉터 (금성) (도 2A 및 2C) 간의 형광 강도 비의 변화로서 검출된다. 다?...

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다.

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Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

대화형, 환자 전용 모델을 사용 하 여 깊은 두뇌 자극 치료를 위한 신경 섬유 책자를 대상으로

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...