Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder 1R21NS064412, concessão NSF 1052048 e Jeffress Memorial Trust concessão J-908.

1. Exemplo de Preparação Nota: Em muitos casos, experimentos de perfusão lavar uma parte significativa de células, o que pode se tornar um problema frustrante. Embora não seja necessário para todas as linhas celulares, as superfícies de vidro com tampa de revestimento de poli-L-Lisina (adicionar 1,0 ml/25 cm2 de solução de 0,01% para a superfície, incubar&gt; 5 min, lavar duas vezes com água de grau de cultura de células, e seco em a cabine de segurança biológica) aume...

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

O sucesso dos experimentos com imagens depende de alguns fatores críticos. Um desses factores é a afinidade dos sensores utilizados, como discutido acima. Concentração absoluta do substrato no compartimento subcelular de interesse, no entanto, é muitas vezes desconhecida. Portanto, recomendamos tentar vários sensores com afinidades escalonados para encontrar o que funciona melhor sob a condição experimental desejado. Por exemplo, no nosso caso, as células COS7 transfectadas com sensores de glutamina com 1.5μ, ...

Devido ao notável progresso em tecnologias que permite o exame do transcriptoma e proteoma em um nível celular, que agora se tornou claro que a bioquímica eo fluxo resultante de metabólitos e íons são altamente celular do tipo específico. Por exemplo, no fígado dos mamíferos, a degradação da glutamina sequencial e síntese são realizadas simultaneamente por células periportais e células perivenosa respectivamente, alimentando de amónio para o ciclo da ureia no primeiro tipo de células, consumindo o excesso de amoníaco no último 1-3. Em alguns casos, a heterogeneidade bioquímica significativa é detectada até mesmo num único &quot;tipo de célula&quot; 4, 5. Em adição a esta especificidade espacial, os níveis de metabolitos celulares e iões são altamente dinâmico (por exemplo, moléculas de sinalização, tais como Ca 2 + e os nucleótidos cíclicos). Os padrões espaço-temporais de metabólitos e íons muitas vezes desempenham papéis críticos na transdução de sinal. MCOMPANHAMENTO dinâmica celular de metabólitos e íons, no entanto, representam desafio único. Em muitos casos, a alteração nas concentrações são rápida e transiente, exemplificada pelo caso de as moléculas de sinalização, tais como Ca 2 +, que se decompõe no ~ 20 ms em espinhas dendríticas 6. Além disso, a compartimentação das vias bioquímicas dentro e entre as células, torna difícil de quantificar a dinâmica de metabolitos e iões utilizando extracção e cromatografia em coluna / técnicas de espectrometria de massa. Sensores codificados geneticamente para moléculas biológicas são agora amplamente utilizados, devido à alta resolução espaço-temporal que permite ao pesquisador a estudar a dinâmica molecular de curta duração e / ou compartimentada (revisada em 7, 8). Estes sensores codificados geneticamente podem ser divididos em duas categorias; Os sensores baseados em intensidade e sensores ratiometic. Os sensores baseados intensidade consistem tipicamente de um domínio de ligação e um gripeproteína orescent (PQ), e a ligação ao domínio de ligação ao soluto muda a intensidade de fluorescência. Sensores Ratiometic, por outro lado, muitas vezes, beneficiar de Transferência de Energia de Ressonância Foster (FRET) entre dois PQ que funcionam como um par de FRET. Estes sensores consistem de um domínio de ligação e dois PQ, e a ligação de soluto induz a alteração na eficiência da TERF entre as duas PQ. Um grande número de sensores para os metabolitos e os iões biologicamente importantes foram desenvolvidos na década passada 8, 9. Um dos excitante possibilidade oferecida por tais sensores geneticamente codificados é a sua utilização na análise de alta-resolução dos processos de transporte de membrana, o que anteriormente não foi fácil de detectar, ao nível celular. Sensores geneticamente codificados facilitar a análise dos mecanismos de transporte, como a especificidade de substrato e dependência do pH 10, 11. Além disso, em combinação com os res genéticosONTES como a biblioteca de RNAi constrói para organismos modelo, agora é possível realizar pesquisas do genoma para processos de transporte inovadoras utilizando sensores codificados geneticamente. Com efeito, a utilização de microrganismos geneticamente codificado sensor de chumbo para a descoberta de transportadores anteriormente não caracterizadas em vários casos, 12, 13. Recentemente, o nosso laboratório tem desenvolvido uma série de sensores baseados em FRET para a glutamina. Demonstrámos que os níveis de glutamina celular pode ser visualizada utilizando tais sensores FRET glutamina 10. Estes sensores consistem de um dador FRET (mTFP1) inserido numa proteína de ligação a glutamina bacteriana glnH, e um aceitador FRET (Vénus) na extremidade C-terminais de glnH (Figura 1). FRET eficiência destes sensores diminuir após a ligação de glutamina, o que resulta na diminuição da relação da intensidade de aceitador / dador. Boa regulação de processos de transporte de glutamina é importante nos processos biológicos, tais como neurotransmissão 14, 15 e a manutenção do ciclo da ureia no fígado 1, 16, 17. Aqui nós mostramos a metodologia de análise de actividades de transporte com sensores Fret para glutamina, usando uma grande-campo microscópio de fluorescência set-up. O objectivo das experiências mostradas aqui são para detectar actividades de transportador numa única célula e para examinar a especificidade do substrato de um transportador transitoriamente expressa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. Uma enorme variedade de tais sensores para moléculas biológicas tornou-se disponível nos últimos 15 anos, algumas das quais se tornaram ferramentas indispensáveis, que são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios. Uma das aplicações interessantes de sensores geneticamente codificados é a utilização destes sensores para investigar os processos de transporte celular. Propriedades de transportadores, tais como a cinética e especificidades de substrato pode ser investigada a um nível celular, oferecendo possibilidades para análises específicas do tipo de célula de actividades de transporte. Neste artigo, vamos demonstrar como a dinâmica do transportador pode ser observado usando sensor de glutamina geneticamente codificado como um exemplo. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos.

Experiências típicas de curso-tempo estão representados na Figura 2. Nestas experiências, FRET sensores de glutamina com afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C e D) foram co-expressos com uma aplicabilidade ASCT2 permutador de aminoácido 18 em células COS7 10. Influxo de glutamina é detectado como uma alteração em razões de intensidade de fluorescência entre o doador (mTFP1) e o receptor (Vénus)...

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.

Glutamina Flux imagem usando sensores codificados geneticamente

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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