Name: rapid identification of gram negative bacteria from blood culture broth using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

<html> 1. Blutkultur Brühen Flagge als &quot;Positiv&quot; <ol><li> Entfernen Sie die signalisiert Blutkulturflasche von der kontinuierlichen Überwachung Brutschrank und legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank. Hinweis: Die Flaschen können gefährliche Mikroorganismen enthalten und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen befolgt werden müssen. Wegen der Gefahr von Infektions Aerosole bei der Probenahme, müssen alle Stichprobenverfahren in einem Biosafety Klasse II Sterilbank durchgeführt werden. </li></ol><...

<ol>
	<li>Bearman, G. M., Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteremias:+a+leading+cause+of+death.">Bacteremias: a leading cause of death.</a> Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).</li><li>Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+appropriate+empirical+antibiotic+treatment+in+patients+with+bloodstream+infection.">The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection.</a> J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+hypotension+before+initiation+of+effective+antimicrobial+therapy+is+the+critical+determinant+of+survival+in+human+septic+shock.">Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock.</a> Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).</li><li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection:+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management.">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).</li><li>Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+on+the+Clinical+Management+of+Patients+With+Gram-negative+Bacteremia:+A+Prospective+Observational+Study.">Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study.</a> Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).</li><li>Dekker, J. P., Branda, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).</li><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+revolution+in+bacteriology:+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li><li>Neville, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+following+introduction+for+routine+laboratory+bacterial+identification.">Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).</li><li>Schmidt, V., Jarosch, A., M&#228;rz, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).</li><li>March-Rossell&#243;, G. A., Mu&#241;oz-Moreno, M. F., de Urri&#233;s, M. C., Bratos-P&#233;rez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+centrifugation+protocol+and+validation+criterion+for+enhancing+mass+spectrometry+(MALDI-TOF)+results+in+microbial+identification+using+blood+culture+growth+bottles.">A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).</li><li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting.">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li><li>Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+Gram-negative+organisms+from+blood+culture+bottles+using+a+modified+extraction+method+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).</li><li>Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+Gram-positive+pathogens+and+their+resistance+genes+from+positive+blood+culture+broth+using+a+multiplex+tandem+RT-PCR+assay.">Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay.</a> J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).</li><li>Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+preparatory+methods+for+detection+of+bacteremia+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).</li><li>Consoir, C., L&#246;rch, D., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+bacteria+from+charcoal-containing+blood+culture+bottles+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionisation+time-of-flight+mass+spectrometry.">Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).</li><li>Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+in-house+method+and+the+commercial+Sepsityper&#8482;+kit+for+bacterial+identification+directly+from+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption-ionisation+time-of-flight+mass+spectrometry.">Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper&#8482; kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).</li><li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).</li><li>Novel, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=improved+sample+preparation+for+rapid,+direct+identification+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+(MALDI-TOF)+mass+spectrometry.">improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.</a> J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).</li><li>Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+of+Bacteria+and+Yeasts+from+Positive-Blood-Culture+Bottles+by+Using+a+Lysis-Filtration+Method+and+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrum+Analysis+with+the+SARAMIS+Database.">Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database.</a> J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).</li></ol>

Es ist wichtig, bei der Anwendung von MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe, die die Post Zentrifugationsschritte werden mit ausreichender Sorgfalt durchgeführt, nicht die getrennten Komponenten remixen. Es ist besonders wichtig, die Blutkulturbestandteilen und humanen zellulären Proteine, einschließlich Hämoglobin, das Spikes Störung der MALDI-TOF-Spektren erzeugen können, zu entfernen. Obwohl MS Hersteller empfehlen der Partitur von ≥ 2,0 für Arten geschnitten und ≥ 1,7 für Gat...

Patienten mit Infektion der Blutbahn (BSI) durch Bakterien weiterhin hohe Mortalität im Krankenhaus haben, angefangen von 6 bis 48% ein. Die Lieferung der entsprechenden Antibiotika fördert das Überleben und in der Untergruppe der Patienten mit schwerer Sepsis, jede Stunde Verzögerung, um eine geeignete Therapie korreliert mit verringerten Überlebens 2,3. Dementsprechend ist ein zentrales Ziel der klinischen Labor, um schnell zu erkennen, zu identifizieren und kommunizieren die Anwesenheit von Bakterien in Blutkulturen, klinische Entscheidungen. Es hat sich gezeigt, dass die mikrobiologischen Labor hat den größten Einfluss auf eine antimikrobielle Therapie bei der Berichterstattung über die Gram-Färbung 4 und vor kurzem eine Beobachtungsstudie gezeigt, dass Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) direkt auf die Blutkulturbrühen durchgeführt beeinflussen Verschreibung in über einem Drittel der BSI, die durch Gram-negative Bakterien verursacht werden 5. 6,7 führte. Die Technologie ist mittlerweile etabliert und hat sich in vielen Labors für die schnelle und genaue Identifizierung von Mikroorganismen isoliert auf festen Medien 6,8 integriert. Die direkte Anwendung der MALDI-TOF-MS zu Blutkultur (BC) Brühe, die für Mikroorganismen appelliert an beide Kliniker und Laborleiter, weil das Potenzial, eine frühere Identifizierung von Mikroorganismen bei niedrigen Kosten zu erhalten &quot;positiv&quot; signalisiert haben. Der klinische Nutzen der direkten Anwendung der MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe wurde von der breiten Palette der beobachteten Empfindlichkeiten beschränkt worden, als mit Standard-phänotypischen Kultur Methoden der Identifizierung, mit Berichten über erfolgreiche Identifizierung von Gram-negativen Bakterien bis hin verglichen 47-98,9 9-11%. Die Variation in der Empfindlichkeit wahrscheinlichbezieht sich auf die Zusammensetzung BC Brühe, Anfangsbakterienkonzentration, Variation in der Probenvorbereitung Methoden sowie die Anordnung von Gram-negativen Organismen in Studienpopulationen 9 gestoßen. Verglichen mit diesen anderen veröffentlichten Protokollen der hier vorgestellten Verfahren vermeidet die Verwendung von Ethanol, Ammoniumchlorid oder zusätzliche (nicht-Matrix) Acetonitril. Als Ergebnis wird das Bakterienpellet lebensfähig bleiben (bis zum Punkt des Proteinextraktion) unter Berücksichtigung der potentiellen phänotypischen Suszeptibilität Testverfahren unmittelbar auf diese Organismen in der Brühe verwendet werden. Darüber hinaus hat das vorgestellte Verfahren wurde gezeigt, kostengünstige, zuverlässige und rasche Identifizierung von Bakterien mit innerhalb von 25 min der Blutkultur Gramfärbung Ergebnisse mit minimalen &quot;hands on&quot; Zeit 12 ist. Diese Methode ist eine einfache Inhouse-Spin-Lyse-Protokoll unter Verwendung von Ameisensäure Extraktion Gram-negative b identifizieren direkt an positiven Blutkulturbrühen angewendetacteria mit MALDI-TOF-MS-Technologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1319">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">BACTEC Plus Aerobic/F Medium</td>
			<td style="width:307px;">Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td align="right" style="width:188px;">442192</td>
			<td style="width:551px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium</td>
			<td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td align="right">442265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BACTEC Peds Plus Medium</td>
			<td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td align="right">442194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacutainer - Blood transfer device</td>
			<td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td align="right">364880</td>
			<td>Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus</td>
			<td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td align="right">367954</td>
			<td>Serum separating tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td align="right">302143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Samco, USA</td>
			<td>222-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette (fine tipped)</td>
			<td>Samco, USA</td>
			<td>232-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge tube (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030.120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile water (DNAse and RNAse free)</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td>
			<td>F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix solution&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen Germany</td>
			<td align="right">285074</td>
			<td>10 mg/ml &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen Germany</td>
			<td></td>
			<td>Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid identification of gram negative bacteria from blood culture broth using maldi-tof mass spectrometry

Eine wichtige Rolle der klinischen Mikrobiologie-Labor ist eine schnelle Identifizierung von Bakterien, die Infektion der Blutbahn liefern. Traditionelle Identifizierung erfordert die Subkultur der signalisiert Blutkulturbrühe mit Identifikations erst verfügbar, nachdem Kolonien auf festen Agar sind gereift. MALDI-TOF-MS ist ein zuverlässiges, schnelles Verfahren zur Identifizierung der meisten klinisch relevanten Bakterien als Kolonien auf festem Medium aufgebracht. Die Anwendung der MALDI-TOF-MS direkt an Blutkulturbrühe ist ein attraktiver Ansatz, da sie das Potenzial hat, Artbestimmung von Bakterien beschleunigen und zu verbessern klinische Management. Allerdings ist ein wichtiges Problem zu überwinden, die Pre-Analyse Entfernung von störenden Harze, Proteine ​​und Hämoglobin in Blutkulturproben, die, wenn nicht entfernt werden, stören die MS-Spektren und kann zu einer unzureichenden oder niedrigen Diskriminierung Identifizierung Partituren Ergebnis enthalten. Zusätzlich ist es notwendig, bacter konzentrierenia zu entwickeln Spektren von ausreichender Qualität. Die vorgestellte Methode beschreibt die Konzentration, Reinigung und Gewinnung von Gram-negativen Bakterien so dass für die frühzeitige Identifizierung von Bakterien aus einer Blutkultur signalisiert Brühe.

Die erzeugte MALDI-TOF MS-Spektren sind mit der integrierten Referenzspektren der Datenbank verglichen. Eine logarithmische Score ist für das Vertrauen der Partie zwischen dem Test-Isolat und der Referenzdatenbank isoliert, mit der Empfehlung von einem Score ≥ 1,7 für wahrscheinlich, Identifikation zu Gattungen Ebene (Abbildung 1) und ≥ 2,0 für wahrscheinliche Identifizierung von Arten (Abbildung erforderlich zugeordnet 2). Bericht zur Art, wenn die Punktzahl ≥...

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Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

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Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

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