Name: multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis
Uploaded: 2014-07-11T14:00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis at JoVE.com

تم تنفيذ البرنامج التعليمي قدمت وطورت في إطار مرفق كور الطيف الكتلي في الصحة القومي اليهودي. ويدعم مرفق NJH MS في جزء من CCSTI UL1 TR000154. التمويل من المنح NIH P20 كما دعمت HL-113445 وR01 HL-095432 هذا العمل.

<ol>
	<li>Beckonert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling,+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine,+plasma,+serum+and+tissue+extracts.">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).</li><li>Clarke, C. J., Haselden, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Profiling+as+a+Tool+for+Understanding+Mechanisms+of+Toxicity.">Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity.</a> Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).</li><li>Wang, X., Zhang, A., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+of+Metabolomics+in+Diagnosis+and+Biomarker+Discovery+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma.</a> Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).</li><li>Collino, S., Martin, F. -. P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Healthy+Metabolic+Trajectories+with+Nutritional+Metabonomics.">Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics.</a> Nutrients. 1, 101-110 (2009).</li><li>Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+in+food+science:+a+review.">Metabolomic analysis in food science: a review.</a> Trends in Food Scienc., &amp; Technology. 20, 557-566 (2009).</li><li>Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics:+a+platform+for+studying+drug+toxicity+and+gene+function.">Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function.</a> Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).</li><li>Wishart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolome Analysis: An Introduction. , 253-288 (2006).</li><li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography&#8211;mass+spectrometry.">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography&#8211;mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).</li><li>Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabonomic+approaches+for+evaluating+physiological+influences+on+biofluid+composition.">NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition.</a> NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).</li><li>Dong, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern HPLC for Practicing Scientists. , (2006).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent-dependent+metabolite+distribution,+clustering,+and+protein+extraction+for+serum+profiling+with+mass+spectrometry.">Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome.">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).</li><li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).</li><li>Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+sample+preparation+approaches+for+phospholipids+profiling+in+human+serum+by+liquid+chromatography&#8211;tandem+mass+spectrometry.">Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography&#8211;tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).</li><li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS-Based+Analysis+of+Human+Plasma+for+Metabonomics+Using+Solvent+Precipitation+or+Solid+Phase+Extraction.">UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li><li>Kerns, E. H., Di, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , (2008).</li><li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., R&#233;m&#233;sy, C., Jim&#233;nez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols:+food+sources+and+bioavailability.">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).</li><li>Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.+Mutations+in+different+proteins+result+in+similar+disease.">The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease.</a> NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).</li><li>Schulze, H., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+lipid+storage+diseases.">Lysosomal lipid storage diseases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Kuhn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+evaluation+of+automated,+multiplexed+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+to+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+quantifying+proteins+in+plasma.">Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).</li><li>Rist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Freezing+and+Storage+Procedure+on+Human+Urine+Samples+in+NMR-Based+Metabolomics.">Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics.</a> Metabolites. 3, 243-258 (2013).</li><li>Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin&#8216;t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Collection+and+Storage+Conditions+for+Catecholamine+Measurements+in+Human+Plasma+and+Urine.">Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine.</a> Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).</li><li>Wood, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+the+human+circulating+endocannabinoid+metabolome:+clinical+sampling+and+sample+storage+parameters.">Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).</li><li>Bahr, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

هدف واحد من الدراسات السريرية metabolomic هو تحديد التغيرات في metabolome المتعلقة المرض أو العلاج. لذا تقنيات تحضير العينات تحتاج إلى أن تكون قوية ومتسقة وقابلة للتحويل من فني لفني ومختبر من المختبرات إلى 22. يحتاج البيانات الناتجة لتكون ممثلة للعينة، والتغييرات التي تم تحديدها يجب أن تعكس العينة تعيين بدلا من أخطاء إعداد العينات. لذا pipetting لدقيقة، درجة الحرارة الصحيحة، الصب كفاءة طبقات إمتزاج، والتجفيف تحت النيتروجين، واستخدام نفس العلامات التجارية وأحجام مختلفة من الأواني الزجاجية ونصائح ضرورية. خلال البروتين هطول الخطوة، فمن الأهمية بمكان أن نفس القدر من الحل هو يصب كل من بيليه. هذا يقلل من التباين في الحجم وعلى هذا النحو يقلل من التباين في بيانات العينة. هذه الخطوة هطول البروتين ضروري لدراسات metabolomic ولا يمكن تخطي لأنه يزيل البروتين منالعينات قبل جزيء صغير التنميط التحليل على مطياف الكتلة. أنه يزيل مسببات الأمراض والجزيئات الكبيرة، والنشرات ملزمة الأيض من البروتينات 7. عدم وجود تراكم البروتين في عينات يوسع العمود عمر HPLC ويزيد من دقة وجودة النتائج. الرقم 5 هو تصوير بيليه البروتين شكلت عند تنفيذ هذه التقنية على عينات البلازما. وهذا يسمح للكشف عن جزيئات صغيرة، ويعزز فرة أيون، ويقلل من الآثار مصفوفة من البروتينات في العينة. بالإضافة إلى ذلك، منذ يفترض أن تتم إزالة جميع البروتينات في هذه الخطوة، فإن الأحماض الأمينية التي يتم الكشف عنها خلال تحليل LC-MS تنبع من التغيرات الأيضية بدلا من انهيار البروتين. الخطوة استخراج السائل السائل أمر بالغ الأهمية لأنه يفصل بين نواتج ماء ومسعور إلى طبقتين إمتزاج. الشكل 6 يبين الإجراء LLE ومندوبresentation طبقة LLE. على فصل غير لائق من طبقتين النتائج في الأيض إما الضياع أو يجري مزال في كل من الكسور. التطبيق الدقيق لهذه الخطوة يقلل من عدد من المركبات المائية التي تظهر في جزء مسعور. نتائج هذه المركبات أصبحت لا يمكن الاعتماد عليها لأنه لا يمكن تحديد جزء الذي يحتوي على نتائج ممثلة. عند القيام به بشكل صحيح، هو انخفاض الأيض التداخل. لمنع تدهور التأكسدي، وخاصة في الدهون ولكن أيضا في الجزيئات الصغيرة التي قد تحتوي على مجموعات ثيول على سبيل المثال، والتعرض للأكسجين يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن. لذلك، يتم تنفيذ هذا الإجراء دائما تحت النيتروجين للحد من / منع أكسدة الدهون أو التي تحتوي على مركبات ثيول. بالإضافة إلى ذلك، نقل عينة و / أو حل سريع (في غضون الدقيقة الاولى) للحد من التعرض الأكسجين، ثم توضع العينات بسرعة تحت دفق مستمر من النيتروجين لتجف أسفل. مرة واحدة المجففة، فهي immediمعلق ately في الميثانول بنسبة 100٪ للأسباب التي ذكرناها آنفا. يمكن الاستفادة من مختبرات هذه الطريقة شاملة في عدد من الطرق؛ يمكن للباحثين تبحث لعزل فئة واحدة من المركبات اختيار جزء من الطريقة التي تناسب احتياجاتهم. أولئك الذين يسعون لأداء سوى هطول البروتين للحصول على مجموعة من نواتج الأيض قد تفعل ذلك. إذا كنت تريد ماء الأيض، مثل العديد من العقاقير الصيدلانية، والأحماض الأمينية، والسكريات، أو إذا كنت تريد فقط الأيض مسعور، مثل الدهون الثلاثية، الكحول، الفيتامينات القابلة للذوبان الدهون، والدهون الفوسفاتية وعلى سبيل المثال، ثم يمكن للباحثين إجراء استخراج السائل السائل الخطوة التالية البروتين هطول الأمطار وتجاهل جزء غير مرغوب فيها. المحققين الذين يحتاجون إلى مزيد من التصنيف الفرعي للمركبات مسعور (الدهون محايدة، والأحماض الدهنية، والدهون الفوسفاتية) قد انتقل إلى الخطوة تجزئة. اعتبارات هامة في التخزين maintainiنانوغرام صلاحية عينات لتحليلها لاحقا. إذا تم تخزين العينات بشكل غير صحيح، يمكن أن يحدث تدهور أو التحلل. من الناحية المثالية، يجب أن يتم تخزين العينات في سقف المسمار قارورة العنبر بعيدا عن الضوء لمنع تدهور الأنواع الحساسة للضوء. وينبغي أيضا أن تبقى العينات المجمدة في -80 درجة مئوية لمنع تدهور الأيض 23-25. على الرغم من عدم مناقشته في التفاصيل هنا، وتحفظ العينات دائما في 4 درجات مئوية في علبة الاوتوماتيكى خلال تحليل LC-MS. هذا يضمن أن جميع العينات وتحفظ في درجة حرارة ثابتة وأن التغيرات في درجة الحرارة المحيطة لا تؤثر على اللزوجة، والذوبان، أو الاستقرار في العينات. فمن المستحسن أن الجوانب دليل من هذا الإجراء، مثل LLE وSPE، أن تمارس من أجل كسب الثقة والراحة مع الخطوات المتبعة. وجود عدد قليل من القيود لهذه التقنية. ليست مضمونة فصل سرية من نواتج الأيض مسعور وماء كما سيتم بعض المركبات inherتقسيم مستديم في كل من الكسور بسبب التركيب الكيميائي ورسوم دولتهم. بالإضافة كما هو مبين في الشكل (4)، وتقنية غير لائق أثناء الخطوة استخراج البروتين بيليه يمكن أن يؤدي ذلك إلى ضعف التكاثر الأيض في كل من العينات ومراقبة الجودة. هذا يؤثر على الإحصاءات، وخصوصا في مجموعات البيانات الصغيرة بسبب قوة إحصائية غير متوفر. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن هذه الخطوة أن يؤديها بالضبط نفس كل مرة عن كل عينة. قيود أخرى هو الوقت. على الرغم من أن هناك نقطة توقف في جميع أنحاء هذا البروتوكول حيث يمكن تجميد العينات واصل الإعدادية في اليوم التالي، يجب تعيين يوم كامل جانبا لتنفيذ هذا الإجراء. ثالثا، ليس كل مركب ضمن عينة بيولوجية يمكن تقييمها لايون القمع. لأنه ليس من الممكن تحديد كيف يمكن للمصفوفة يؤثر كل أيض الفردية، والخيار الحالي هو تقييم المعايير الداخلية التي تحاكي نظريا بعض فئات endogenouق الأيض. أخيرا، تحديد الهوية المطلقة لا يمكن أن يؤديها فقط مع هذا الأسلوب. مطلوبة جنبا إلى جنب MS بالتعاون مع عمليات البحث ومعايير قاعدة البيانات لتحديد المستقلب المطلقة. جزءا هاما من الايض هو تحديد المركبات. على الرغم من عدم مناقشته في التفاصيل هنا، وقد تم تحليل عينات مراقبة الجودة باستخدام LC-MS. تم إعداد الفراغات إعداد العينات متعددة والفراغات أداة لاستخدامها بوصفها خلفية الطرح لخفض معدل من ايجابيات كاذبة من الملوثات، مما يؤدي إلى الفعالية المستقلب أكثر موثوقية. بعد هذه الخطوة، تم تجميع عدد من &quot;الميزات الجزيئية&quot; معا على أساس م / ض، الوقت الاحتفاظ، نسبة النظائر، وadducts لإنتاج قائمة من المركبات الفعلية. على الرغم من أن قائمة من المركبات وتقلص إلى حد كبير، وكانت النتائج أكثر موثوقية لأنها لا تستند إلى adducts متعددة من نفس المجمع. طريقة كاملة شاملة ويسمح isolatioن من نواتج الأيض مسعور مثل الدهون محايدة، الدهون الفوسفاتية والأحماض الدهنية والدهون الثلاثية، والمنشطات، وعزل أيضا الطبقات المائية في جزء مائي، منها eicosanoids، وقد تم تحديد السكريات، الفلافونويد، والأحماض الأمينية 12، 26.

ردود الفعل البيولوجية توليد نواتج كمنتجات نهاية العمليات الخلوية. الايض هو مجموعة من جميع المركبات الموجودة في الكائن الحي نتيجة لهذه العمليات. أنه يوفر صورة للعلم وظائف الأعضاء من الخلايا ويعكس استجابة الكائن الحي للمؤثرات خارجية أو داخلية 1، 2. مثل هذه المحفزات يمكن أن يكون البيئية، السمية، الدوائية والغذائية والهرمونية، أو ذات الصلة لهذا المرض. العديد من التطبيقات metabolomic لها ويجري حاليا دراستها من قبل الباحثين وتشمل العلامات البيولوجية اكتشاف 3، 4 دراسات التغذية والعلوم الغذائية 5، 6 واختبار المخدرات. بغض النظر عن التطبيق، والاختلافات في البيانات، والتلوث، وجود ايجابيات كاذبة تحتاج إلى خفض أو إزالة يفضل. في اكتشاف العلامات البيولوجية أو في حالة تحديد الاختلافات بين السيطرة ومجموعة أمراض، أو التحقيق في آثار المخدرات على الموضوعات، وو البيولوجيةيتم اختيار luid بناء على الأسئلة التي وأنواع الأيض يجري التحقيق 7. على سبيل المثال، إذا دراسة الآثار المباشرة للدواء استنشاق في الرئتين من المصابين بالربو، ثم استكشاف الأيض في السائل غسل القصبات (BALF) عينات قبل وبعد الإدارة سيكون تفضيلية. لضمان أن لاحظ اختلافات بسبب الاختلاف البيولوجي الفعلي بدلا من أسلوب غير لائق إعداد العينات، وبروتوكول المختبر موحدة ومتسقة ضروري 8. يجب توثيق المعلومات العينة بعناية للتأكد من أن المتغيرات مثل السوائل البيولوجية، سلالة الحيوان، والوقت أخذ العينات، وعمر الموضوع، بين الجنسين، على سبيل المثال لا الحصر، تعتبر كل ويؤخذ في الاعتبار في الدراسة 9. بالإضافة إلى ذلك، للحد من إمكانية تلوث أو ايجابيات كاذبة، فمن المستحسن أن الفراغات المذيبات والفراغات أداة يتم تحليلها 10. لهذا البروتوكول، فإن مصطلح &quot;METABOالصنعية &quot;سوف تستخدم للإشارة إلى مركبات الفعلية التي تم تحديدها. باستخدام البرمجيات بائع، ويستخدم خوارزمية الذروة النتيجة الأولية للكشف عن القمم الطيفية الشامل. تتماشى هذه القمم على أساس الكتلة إلى تهمة (م / ض) ونسبة الاحتفاظ الوقت. ثم يتم استخدام خوارزمية الثاني على الجمع بين ميزات متعددة في مركب واحد. وهذا يشمل ميزات مثل الصوديوم والبوتاسيوم والأمونيوم أو adducts في وضع التأين إيجابية، وكلوريد في وضع الأيونات السالبة. وتشمل الخيارات الإضافية في البرنامج ميزات مثل dimers وadducts الأخرى. باستخدام الجلوكوز على سبيل المثال، مع وجود قمم في 181.0707 م / ض (M + H)، 198،0972 م / ض (M + NH 4)، و203.05261 م / ض (M + نا)، سيكون هناك ثلاث قمم المقابلة لنفس تفاقم باستخدام خوارزمية الأولى. ولكن عندما الخوارزمية الثانية، والتي تقوم على الصيغة الجزيئية، ويتم تطبيق هذه adducts ثلاثة تصبح تجميعها معا مما أدى إلى مجمع واحد. يمكن أن تؤدي التدخلات الأيضية داخل عصيدةليه نظرا لتعقيد المركبات الحالية. وجود الآلاف من المركبات في إحدى أسباب عينة إشارة قمع ولا سيما من أقل الأيض وفرة. تنظيف العينة لإزالة التداخل والبروتينات، وفصل لاحق إلى كسور متعددة يقلل من تعقيد العينة وبالتالي تحسين فصل الذروة، وزيادة القرار، والحد من المستقلب coelution. وبالتالي، مطلوب تنظيف العينة وتحسين فصل المركبات. وقد تبين أن هطول البروتين وحده، حتى مع استخدام مختلف المذيبات القطبية، لا يمكن حل هذه المسألة 11، 12. ومع ذلك، من خلال الجمع بين المذيبات العضوية القوية مثل MTBE مع خطوة تجزئة اللاحقة، يتم زيادة التغطية الأيض. يانغ وآخرون 12 عن زيادة في التمثيل الغذائي من 1،851 أو 2،073 مع الميثانول أو هطول الميثانول الإيثانول وحدها على التوالي، ل3،806 الأيضية باستخدام الاستخلاص بالمذيبات MTBE مجتمعةتليها المرحلة الصلبة استخراج (SPE) الخطوات. ولوحظ انخفاض التداخل الأيض، وتحسين فصل الذروة وزيادة وفرة المستقلب مع هذا الأسلوب. التلوث من غير الأيضية، مثل البوليمرات، يمكن أن تنجم عن جمع العينات، والمذيبات، أو ضوضاء الصك، ويمكن أن يؤدي إلى قمع إشارة من نواتج محتملة كبيرة. فمن المستحسن أن فني (ق) والذين جمع العينات قبل أخذ عينات إعداد باستمرار استخدام نفس العلامة التجارية، ونوع وحجم قارورة جمع العينات، نصائح ماصة وأي الأنابيب الأخرى المستخدمة خلال جمع وإعداد العينات. وهذا يسمح للمحلل البيانات لدينا ثقة كاملة أن التغيرات الملحوظة حقيقية وليست بسبب وجود خلافات أساسية من مصادر أخرى. فعالية العلاج، والاختلافات بين مجموعات من الأمراض ومكافحتها، أو أي التحليلات الأيضية الأخرى ويمكن بعد ذلك يتم التحقيق مع زيادة الثقة. وميثالتطوير التنظيمي مناقشتها هنا يركز على طرق إعداد العينات مجتمعة 13-15 والتي يمكن تطبيقها على البلازما، BALF، أو السائل النخاعي (CSF) عينات لتحديد ملامح metabolomic غير المستهدفة للاللوني الشامل السائل قياس الطيف (LCMS) التحليل القائم. كلا اللوني السائل (LC) وفائقة الأداء اللوني السائل (UPLC) تقنيات الفصل يمكن أن يقترن إلى MS اللاحقة لهذا الإجراء. إجراء دراسات metabolomic العديد من الباحثين استخدام إما بروتين هطول تقنية و / أو تقنية استخراج السائل السائل 16، 17. في دراساتنا، وهذا أدى إلى عدد أقل من مستقلبات أن يتم اكتشافها. الطريقة الموضحة هنا 12 تمكن الكشف والتعرف على عدد أكبر من المركبات، التي تغطي مجموعة واسعة من metabolome. ويرجع ذلك إلى نقاء أعلى من العينات وتقليل الآثار الناجمة عن الانفصال مصفوفة مسبقة من الطبقات المستقلب هذه الزيادة. على البروتوكول الاضافي الأوليةيتم تنفيذ عين هطول خطوة باستخدام الميثانول الباردة (MeOH) لإزالة البروتين من العينة. يستخدم استخراج السائل السائل (LLE) باستخدام الميثيل ثالثي بوتيل الأثير (MTBE) والماء لفصل المركبات ماء ومسعور. ثم يتم تنفيذ المرحلة استخراج الصلبة (SPE) على طبقة مسعور لفصل المركبات مسعور الى ثلاث فئات - الأحماض الدهنية، الدهون المحايدة، والدهون الفوسفاتية. وأعيد الكسور مسعور في الميثانول بنسبة 100٪، في حين يتم إعادة تشكيل جزء ماء في 5٪ أسيتونتريل في الماء. يوفر استخراج (SPE) الخطوة المرحلة الصلبة كان مستوى أضاف الثقة في النتائج عن طريق الحد من عدد من المركبات coeluting التي من شأنها أن يكون الأمر خلاف ذلك الحاضر خطوة الانفصال لم يتم تنفيذها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A955-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L-6815</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C606-1</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Hexane</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34859</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">49199-50ML-F</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methyl tert-butyl ether</td>
			<td style="width:163px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9042-03</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34965-2.5L</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Water</td>
			<td style="width:163px;">Honeywell Burdick &#38; Jackson</td>
			<td style="width:119px;">365-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">OA-SYS heating system</td>
			<td style="width:163px;">Organomation Associates, Inc</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">12-position vacuum manifold</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">Strata NH2 (55&#181;M, 70&#197;) 100mg/mL SPE cartridges</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">8B-S009-EAK</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass pipette tips</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20C</td>
			<td style="width:183px;">Used to transfer sample to SPE column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Plastic pipette tips</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1182-1830</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used when glass tips are not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">1182-8810</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Graduated glass pipets</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-27B</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used to transfer organic solvents during sample prep</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">13-678-27E</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Pyrex glass culture tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">99499-16X</td>
			<td style="width:183px;">Used to store aqueous and lipid fractions until the next step</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0545</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Snap cap vials for autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0541</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass inserts</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5183-2085</td>
			<td style="width:183px;">Used for small sample volumes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Qualitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.06.00</td>
			<td style="width:183px;">Used to monitor retention times and pressure curves</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Quantitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.05.02</td>
			<td style="width:183px;">Used to analyze quality control and sample data</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Mass Profiler Professional software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.12.50</td>
			<td style="width:183px;">Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis

الايض هو حقل الناشئة والتي تمكن من التنميط عينات من الكائنات الحية من أجل الحصول على نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية. وهناك جانب حيوي من الايض هو إعداد العينات حيث تقنيات توليد تتعارض النتائج لا يمكن الاعتماد عليها. هذا الأسلوب يشمل هطول البروتين، واستخراج السائل السائل، والمرحلة الصلبة استخراج كوسيلة لنواتج الأيض بكسر في أربعة فصول متميزة. يتم الحصول على تحسن تخصيب جزيئات فرة منخفضة مع الزيادة الناتجة في الحساسية، ويؤدي في النهاية إلى تحديد أكثر ثقة من الجزيئات. وقد تم تطبيق هذه التقنية لالبلازما، السائل غسل القصبات، وعينات السائل النخاعي مع انخفاض أحجام مثل 50 ميكرولتر. عينات يمكن استخدامها لتطبيقات المصب متعددة؛ على سبيل المثال، بيليه الناجمة عن هطول البروتين يمكن تخزينها لتحليلها لاحقا. طاف من هذه الخطوة يخضع لاستخراج السائل السائل باستخدامالماء والمذيبات العضوية القوية لفصل المركبات ماء ومسعور. مرة واحدة مجزأة، يمكن معالجة طبقة ماء لتحليلها لاحقا أو التخلص منها إن لم يكن الحاجة. وكذلك التعامل مع جزء مسعور مع سلسلة من المذيبات خلال ثلاث مراحل الصلبة الخطوات استخراج لفصلها إلى الأحماض الدهنية والدهون محايدة، والدهون الفوسفاتية. وهذا يسمح للفني المرونة لاختيار أي ويفضل فئة من المركبات للتحليل. كما أنه يساعد في تحديد المستقلب أكثر موثوقية منذ بعض المعارف من الدرجة الكيميائية موجودا.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis at JoVE.com

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

موثوقية النتائج في التجارب الايض تعتمد على فعالية واستنساخ إعداد العينة. ووصف هو أسلوب دقيق ومتعمق التي تمكن من استخراج نواتج الأيض من السوائل البيولوجية مع خيار تحليل في وقت لاحق تصل إلى الآلاف من المركبات، أو مجرد فصول مجمع المصالح.

تقنيات إعداد متعددة الخطوات لاسترداد فئات متعددة للمجمع المستقلب في العمق والتحليل Metabolomic الإعلامية

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

إعداد وتحليل الضوئي المركبات الخلوية تحتوي على الذهب نانواعواد

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

الشريط: والقابلة للتحلل مرقئ الغراء مستوحاة من مجمع في كل مكان في النباتات لتطبيق الجراحي

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

إعداد وتحليل<em&gt; في المختبر</em&gt; ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

متعدد خطوة الطباعة التصويرية متغير الطول لمحكم بصمام متعدد الأجهزة ميكروفلويديك

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...