Name: multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis
Uploaded: 2014-07-11T14:00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis at JoVE.com

ההדרכה שהוצגה בוצעה ופותחה בתוך מתקן Core ספקטרומטריית המסה בבית הלאומי יהודית הבריאות. מתקן NJH MS נתמך בחלקו על ידי CCSTI UL1 TR000154. מימון ממענקי NIH P20 HL-113445 וR01 HL-095,432 נתמכים גם על עבודה זו.

<ol>
	<li>Beckonert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling,+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine,+plasma,+serum+and+tissue+extracts.">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).</li><li>Clarke, C. J., Haselden, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Profiling+as+a+Tool+for+Understanding+Mechanisms+of+Toxicity.">Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity.</a> Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).</li><li>Wang, X., Zhang, A., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+of+Metabolomics+in+Diagnosis+and+Biomarker+Discovery+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma.</a> Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).</li><li>Collino, S., Martin, F. -. P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Healthy+Metabolic+Trajectories+with+Nutritional+Metabonomics.">Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics.</a> Nutrients. 1, 101-110 (2009).</li><li>Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+in+food+science:+a+review.">Metabolomic analysis in food science: a review.</a> Trends in Food Scienc., &amp; Technology. 20, 557-566 (2009).</li><li>Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics:+a+platform+for+studying+drug+toxicity+and+gene+function.">Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function.</a> Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).</li><li>Wishart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolome Analysis: An Introduction. , 253-288 (2006).</li><li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography&#8211;mass+spectrometry.">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography&#8211;mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).</li><li>Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabonomic+approaches+for+evaluating+physiological+influences+on+biofluid+composition.">NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition.</a> NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).</li><li>Dong, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern HPLC for Practicing Scientists. , (2006).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent-dependent+metabolite+distribution,+clustering,+and+protein+extraction+for+serum+profiling+with+mass+spectrometry.">Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome.">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).</li><li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).</li><li>Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+sample+preparation+approaches+for+phospholipids+profiling+in+human+serum+by+liquid+chromatography&#8211;tandem+mass+spectrometry.">Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography&#8211;tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).</li><li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS-Based+Analysis+of+Human+Plasma+for+Metabonomics+Using+Solvent+Precipitation+or+Solid+Phase+Extraction.">UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li><li>Kerns, E. H., Di, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , (2008).</li><li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., R&#233;m&#233;sy, C., Jim&#233;nez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols:+food+sources+and+bioavailability.">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).</li><li>Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.+Mutations+in+different+proteins+result+in+similar+disease.">The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease.</a> NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).</li><li>Schulze, H., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+lipid+storage+diseases.">Lysosomal lipid storage diseases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Kuhn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+evaluation+of+automated,+multiplexed+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+to+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+quantifying+proteins+in+plasma.">Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).</li><li>Rist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Freezing+and+Storage+Procedure+on+Human+Urine+Samples+in+NMR-Based+Metabolomics.">Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics.</a> Metabolites. 3, 243-258 (2013).</li><li>Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin&#8216;t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Collection+and+Storage+Conditions+for+Catecholamine+Measurements+in+Human+Plasma+and+Urine.">Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine.</a> Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).</li><li>Wood, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+the+human+circulating+endocannabinoid+metabolome:+clinical+sampling+and+sample+storage+parameters.">Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).</li><li>Bahr, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אחת ממטרות מחקרי metabolomic הקליניים היא לזהות שינויים בmetabolome הקשורים למחלה או טיפולים. לכן טכניקות הכנת מדגם צריכים להיות חזק, עקבי וניתנים להעברה מטכנאי לטכנאי וממעבדה למעבדה 22. את הנתונים המתקבלים צריך להיות נציג של המדגם, ושינויים שזוהו צריכים לשקף את המדגם שנקבע ולא שגיאות הכנת מדגם. לכן pipetting מדויק, טמפרטורה נכונה, decanting יעיל של שכבות immiscible, ייבוש תחת חנקן, ושימוש באותו המותגים וגדלים של כלי זכוכית וטיפים נחוצים. במהלך שלב המשקעים חלבון, זה קריטי, כי את אותה הכמות של פתרון יצקה מכל גלולה. הפעולה זו מפחיתה את השונות בעוצמת קול ובתור שכזו מפחיתה את השונות בנתונים לדוגמה. צעד משקעים חלבון זה הוא הכרחי ללימודי metabolomic ולא ניתן לדלג שכן הוא מסיר את החלבון מןהדגימות לפני המולקולה קטנה פרופיל ניתוח על ספקטרומטר המסה. זה מבטל פתוגנים ומקרומולקולות גדולות, ומשחרר מחויבים מטבוליטים מחלבונים 7. חוסר הצטברות חלבון בדגימות מרחיב את החיים עמודת HPLC ומגביר את הדיוק ואת איכות תוצאות. איור 5 הוא תיאור של גלולה החלבון שנוצרה בעת ביצוע טכניקה זו על דגימות פלזמה. זה מאפשר זיהוי של המולקולות קטנות, משפר שפע יון, ומפחית את השפעות מטריצה ​​מחלבונים במדגם. בנוסף, מאחר שהנחה הוא שכל החלבונים מוסרים בשלב זה, חומצות אמינו, המתגלים במהלך ניתוח LC-MS יהיו מקורן שינויים מטבוליים ולא מפירוק חלבון. שלב חילוץ נוזל הנוזל הוא קריטי שכן הוא מפריד בין מטבוליטים הידרופילי ו הידרופובי לשתי שכבות immiscible. איור 6 מציג את הליך האיל ונציגresentation של שכבת האיל. הפרדה לא תקינה של שתי שכבות התוצאה מטבוליטים או ללכת לאיבוד או להיות eluted בשני השברים. יישום זהיר של צעד זה מפחית את מספר התרכובות הידרופיליות המופיעות בחלק הידרופובי. התוצאות עבור התרכובות אלה הופכים בלתי אמינות שכן הוא לא ניתן לקבוע שחלק מכיל את תוצאות הנציג. כאשר נעשה בצורה נכונה, חפיפה המטבוליט מצטמצמת. כדי למנוע השפלה חמצוני, במיוחד בשומנים, אלא גם במולקולות קטנות שיכול להכיל קבוצות תיאול לדוגמא, חשיפה לחמצן צריכה להישמר עד למינימום. לפיכך, הליך זה תמיד מבוצע תחת חנקן להפחתה / מניעת חמצון של שומנים בדם או תרכובות המכילה תיאול. בנוסף, העברת המדגם ו / או הפתרון היא מהירה (בדקה הראשונה) כדי להפחית את החשיפה לחמצן, ולאחר מכן דגימות מונחות תחת זרם יציב של חנקן במהירות להתייבש למטה. יבש פעם אחת, הם היא מידresuspended ately במתנול 100% מהסיבות שפורטו לעיל. מעבדות יכולות להפיק תועלת משיטה מקיפה זו במספר הדרכים; חוקרים מחפשים לבודד סוג אחד של תרכובות יכולים לבחור חלק מהשיטה שמתאימה ביותר לצרכיהם. אלה המבקשים לבצע משקעים חלבון רק כדי להשיג בריכה של מטבוליטים יכולים לעשות כן. אם מטבוליטים הידרופילי הם רצויים, כגון תרופות רבות תרופות, חומצות אמינו, וסוכרים, או אם רק מטבוליטים הידרופובי הם רצויים, כגון טריגליצרידים, אפוקסים, ויטמינים מסיסים בשומן, פוספוליפידים ולמשל, אז חוקרים יכולים לבצע שאיבת נוזל הנוזל הצעד הבא משקעים חלבון וזורקים את החלק רצוי. חוקרים שדורשים סיווג משנה נוסף של התרכובות הידרופוביות (שומנים ניטראליים, חומצות שומן, פוספוליפידים ו) יכולים להמשיך לשלב חלוקה. שיקולי חפצים חשובים בmaintaining את הכדאיות של דגימות לצורך הניתוח מאוחר יותר. אם דגימות מאוחסנות בצורה לא נכונה, השפלה או פירוק יכולה להתרחש. באופן אידיאלי, יש לאחסן דגימות בבקבוקוני ענבר כובע בורג במרחק של אור כדי למנוע השפלה של מינים רגישים לאור. צריכים גם להישמר דגימות קפואות ב -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה המטבוליט 23-25. למרות שלא נידונו בפירוט כאן, דגימות נשמרות תמיד על 4 מעלות צלזיוס במגש autosampler במהלך ניתוח LC-MS. הדבר מבטיח כי כל הדגימות נשמרות בטמפרטורה קבועה, וכי שינויים בטמפרטורת הסביבה אינו משפיעים על הצמיגות, מסיסות, או היציבות של הדגימות. מומלץ כי ההיבטים ידניים של הליך זה, כגון איל וSPE, להיות מתורגל כדי לרכוש את אמונו ונוחות עם הצעדים מעורבים. כמה מגבלות קיימות לטכניקה זו. הפרדה דיסקרטית של מטבוליטים הידרופובי והידרופילי אינה מובטחת כמו תרכובות מסוימות inher תהיהently לחלק לשני השברים בשל מצב ההרכב כימי ותשלום שלהם. בנוסף, כפי שמוצג באיור 4, טכניקה פסולה בשלב חילוץ גלולה חלבון יכול לגרום לשחזור המטבוליט עניים בשתי הדגימות ובקרת איכות. זה משפיע על הסטטיסטיקה, במיוחד במערכי נתונים קטנים בגלל הכוח הסטטיסטי אינו זמין. לכן זה קריטי, כי צעד זה יבוצע בדיוק באותו הזמן בכל עבור כל דגימה. מגבלה נוספת היא זמן. למרות שיש נקודות עצירה לאורך כל הפרוטוקול הזה שבו אפשר להקפיא דגימות וההכנה המשיכה ביום שלמחרת, יש לקבוע יום שלם הצידה כדי לבצע הליך זה. שלישית, לא כל מתחם בתוך מדגם ביולוגי ניתן להעריך לדיכוי יון. מאחר שלא ניתן לזהות כיצד המטריצה ​​משפיעה על כל המטבוליט בודד, האפשרות הנוכחית היא להעריך את הסטנדרטים הפנימיים אשר באופן תיאורטי לחקות כמה סוגים של endogenouמטבוליטים של. לבסוף, לא ניתן לבצע זיהוי מוחלט אך ורק בשיטה זו. טנדם MS בשיתוף עם חיפושים במאגר נתונים ותקנים הנדרשים לזיהוי המטבוליט מוחלט. חלק חשוב של metabolomics הוא זיהוי של תרכובות. למרות שלא נידון בפירוט כאן, דגימות בקרת האיכות נותחו באמצעות LC-MS. כדורי סרק מרובים מדגם הכנה ואת החסר מכשיר הוכנו לשימוש כרקע חיסור כדי להפחית את השיעור של תוצאות חיוביות שגויות ממזהמים, ובכך וכתוצאה מלהיטי המטבוליט אמינים יותר. בעקבות צעד זה, מספר &quot;תכונות מולקולריות&quot; קובצו יחד על בסיס מ &#39;/ z, זמן שמירה, יחס איזוטופ, וadducts לייצר רשימה של תרכובות בפועל. למרות שהרשימה של תרכובות הייתה פחותה בהרבה, התוצאות היו אמינות יותר כפי שהם אינם מבוססים על adducts מרובה מאותו המתחם. השיטה המלאה היא מקיפה ומאפשרת isolation של מטבוליטים הידרופובי כגון שומנים ניטראליים, פוספוליפידים, חומצות שומן, טריגליצרידים, וסטרואידים, אך גם בידוד כיתות הידרופילי בחלק המימית, מתוכם eicosanoids, סוכרים, פלבנואידים, וחומצות אמינו זוהו 12, 26.

תגובות ביולוגיות לייצר מטבוליטים כמוצרים סופיים של תהליכים תאיים. Metabolomics הוא אוסף של כל התרכובות קיימות באורגניזם כתוצאה מתהליכים אלה. הוא מספק תמונה של הפיסיולוגיה של תאים ומשקף תגובה של האורגניזם לגירויים חיצוניים או פנימיים 1, 2. גירויים כאלה יכולים להיות סביבתיים, טוקסיקולוגי, תרופתיים, תזונתיים, הורמונליים, או הקשורים למחלה. יש יישומי metabolomic רבים וכעת הם נחקרים על ידי חוקרים וכוללים סמנים ביולוגיים גילוי 3, לימודי תזונה 4, מדעי מזון 5, ובדיקות סמים 6. ללא תלות ביישום, שינויים בנתונים, זיהום, ונוכחות של תוצאות חיוביות שגויות צריכים להיות מופחתים או רצוי להסירו. בגילוי סמן ביולוגי או במקרה של קביעת הבדלים בין בקרה וקבוצת מחלה, או לחקור השפעות של תרופות על נושאים, ו ביולוגיluid נבחר מבוססת על השאלות שהוא שאל והסוגים של מטבוליטים נחקרים 7. לדוגמא, אם לומד את ההשפעות מיידיות של תרופה בשאיפה על הריאות של חולי אסתמה, ולאחר מכן לבחון מטבוליטים בנוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (בלף) דגימות לפני ואחרי הנטילה יהיה מועדף. כדי להבטיח שנצפה הבדלים הם עקב וריאציה ביולוגית בפועל ולא מדגם טכניקת הכנה לא תקינה, פרוטוקול מעבדה סטנדרטי ועקבי הוא חיוני 8. מידע מדגם חייב להיות מתועד בקפידה כדי להבטיח שמשתנים כגון נוזל ביולוגי, זן בעלי חיים, זמן דגימה, גיל נושא, מין, עד כמה שם, כולם נחשבים ונלקח בחשבון במחקר 9. בנוסף, כדי לצמצם את האפשרות של זיהום או חיובי שגוי, מומלץ שחסר ממס ואת החסר מכשיר להיות מנותח 10. עבור פרוטוקול זה, METABO המונח &quot;לייט &quot;ישמש להתייחס לתרכובות בפועל מזוהות. באמצעות ספק תוכנה, אלגוריתם ממצא שיא ראשוני משמש כדי לזהות פסגות רפאים המוניות. פסגות אלה מיושרים המבוססים על יחס בין מסה למטען (m / z) ושמירת זמן. אלגוריתם שני לאחר מכן נעשה שימוש כדי לשלב תכונות מרובות לתוך מתחם אחד. זה כולל תכונות כגון נתרן, אשלגן, או adducts אמוניום במצב היינון החיובי, וכלוריד במצב היונים השלילי. אפשרויות נוספות בתוכנה כוללות תכונות כגון הדימרים וadducts אחרים. שימוש בגלוקוז כדוגמא, עם פסגות ב181.0707 מ &#39;/ z (M + H), 198.0972 מ&#39; / z (M + NH 4), ו203.05261 מ &#39;/ z (M + Na), יהיו שלוש פסגות המתאימות לאותו מתחם באמצעות האלגוריתם הראשון. עם זאת, כאשר האלגוריתם השני, המבוסס על נוסחה מולקולרית, מוחל שלושה adducts אלה הופך מקובצים יחד וכתוצאה ממתחם אחד. מטבוליטים יכולים לגרום להפרעות בsamples בשל המורכבות של תרכובות הווה. נוכחותם של אלפי מטבוליטים בגורמי דגימה אחת לאותת דיכוי במיוחד של מטבוליטים שפע נמוכים יותר. ניקוי מדגם להסיר מפריע חלבונים, וההפרדה הבאה לשברים מרובים מפחיתה את המורכבות של המדגם ובכך לשפר את הפרדת שיא, הגדלת רזולוציה, והפחתת Coelution המטבוליט. לכן, נדרשים ניקוי מדגם משופר והפרדה של תרכובות. הוכח כי משקעים חלבון לבד, אפילו עם השימוש בממסים קוטבי שונים, לא יכול לפתור בעיה זו 11, 12. עם זאת, על ידי שילוב של ממס אורגני חזק כגון MTBE בצעד חלוקה שלאחר מכן, כיסוי המטבוליט הוא גדל. יאנג et al. 12 דיווחו על עלייה במטבוליטים מ1,851 או 2,073 עם מתנול או ממטרים מתנול אתנול בלבד בהתאמה, ל3,806 מטבוליטים באמצעות מיצוי בממסים MTBE בשילובאחרי מיצוי מוצק שלב צעדים (SPE). חפיפה מופחתת המטבוליט, הפרדת שיא משופרת ושפע המטבוליט מוגבר נצפו עם שיטה זו. זיהום מהלא מטבוליטים, כגון פולימרים, יכול לנבוע מאיסוף דגימה, ממסים, או רעש של מכשיר, והוא יכול לגרום לדיכוי אות של מטבוליטים שעלולים להיות משמעותיים. מומלץ כי הטכנאי (ים) ומי לאסוף את הדגימות לפני לדגום הכנה באופן עקבי להשתמש באותו מותג, סוג וגודל בקבוקוני איסוף דגימה, הטיפים פיפטה וכל צינורות אחרים המשמשים במהלך האיסוף וההכנה של הדגימות. זה מאפשר לאנליסט נתונים יש ביטחון מלא שהשינויים שנצפו הם אמיתיים ולא בשל הבדלי רקע ממקורות אחרים. יעילות טיפול, הבדלים בין קבוצות מחלה ובקרה, או כל ניתוחים מטבוליים אחרים אז יכולים להיות שנחקרו בביטחון מוגבר. ספידOD דן כאן מתמקד בשיטות משולבות מדגם הכנת 13-15 אשר יכול להיות מיושמות על פלזמה, בלף, או נוזל המוח והשדרה (CSF) דגימות לפרופיל metabolomic הלא ממוקד לספקטרומטריית נוזל כרומטוגרפיה מסה (LCMS) ניתוח מבוסס. שתי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) וכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) יכולה להיות בשילוב טכניקות הפרדה לטרשת נפוצה לאחר הליך זה. חוקרים רבים מבצעים מחקרי metabolomic להשתמש גם בטכניקת משקעים חלבון ו / או טכניקת נוזל נוזל מיצוי 16, 17. במחקרים שלנו, כל זה הסתיים בפחות מטבוליטים שיראו. השיטה המתוארת כאן 12 מאפשרת איתור וזיהוי של מספר גדול יותר של מטבוליטים, המשתרע על מגוון רחב יותר של metabolome. גידול זה נובע מהטוהר גבוה יותר של הדגימות ואפקטי מטריצה ​​מופחתות שנגרמו על ידי הפרדה מראש של שיעורי המטבוליט. Prot ראשוניצעד ממטרים עין מתבצע באמצעות מתנול הקר (MeOH) כדי להסיר חלבון מן המדגם. מיצוי נוזל נוזל (איל) באמצעות אתר מתיל טרט בוטיל (MTBE) ומים משמש להפרדת התרכובות הידרופילי והידרופובי. ואז מיצוי מוצק שלב (SPE) מבוצע על השכבה הידרופובי להפריד את התרכובות הידרופובי לשלושה סוגים - חומצות שומן, שומנים ניטראליים, ופוספוליפידים. שברים הידרופובי מחדש במתנול 100%, ואילו חלק קטן הידרופילי הוא מחדש באצטוניטריל 5% במים. הצעד מוצק שלב חילוץ (SPE) מספק רמה נוספת של ביטחון בתוצאות על ידי צמצום מספר תרכובות coeluting אשר אחרת היה להיות נוכחים הייתה צעד הפרדה לא בוצע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A955-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L-6815</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C606-1</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Hexane</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34859</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">49199-50ML-F</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methyl tert-butyl ether</td>
			<td style="width:163px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9042-03</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34965-2.5L</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Water</td>
			<td style="width:163px;">Honeywell Burdick &#38; Jackson</td>
			<td style="width:119px;">365-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">OA-SYS heating system</td>
			<td style="width:163px;">Organomation Associates, Inc</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">12-position vacuum manifold</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">Strata NH2 (55&#181;M, 70&#197;) 100mg/mL SPE cartridges</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">8B-S009-EAK</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass pipette tips</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20C</td>
			<td style="width:183px;">Used to transfer sample to SPE column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Plastic pipette tips</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1182-1830</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used when glass tips are not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">1182-8810</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Graduated glass pipets</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-27B</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used to transfer organic solvents during sample prep</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">13-678-27E</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Pyrex glass culture tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">99499-16X</td>
			<td style="width:183px;">Used to store aqueous and lipid fractions until the next step</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0545</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Snap cap vials for autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0541</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass inserts</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5183-2085</td>
			<td style="width:183px;">Used for small sample volumes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Qualitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.06.00</td>
			<td style="width:183px;">Used to monitor retention times and pressure curves</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Quantitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.05.02</td>
			<td style="width:183px;">Used to analyze quality control and sample data</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Mass Profiler Professional software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.12.50</td>
			<td style="width:183px;">Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis

Metabolomics הוא תחום מתפתח אשר מאפשר אפיון של דגימות מיצורי חיים על מנת לקבל תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים. היבט חיוני של metabolomics הוא הכנת מדגם לפיו עולות בקנה אחד טכניקות להפיק תוצאות לא אמינות. טכניקה זו כוללת משקעים חלבון, מיצוי נוזל נוזל, ומיצוי מוצק שלב כאמצעי fractionating מטבוליטים לארבע כיתות נפרדות. העשרה משופרת של מולקולות שפע נמוכות עם גידול וכתוצאה מרגישות מתקבלת, וסופו של דבר גורמת לזיהוי בטוח יותר של מולקולות. טכניקה זו הוחל על פלזמה, נוזל שטיפת רונכואלוואולרית, ודגימות נוזל השדרה עם נפחים נמוכים כמו 50 μl. דוגמאות יכולות לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים; לדוגמא, את הכדור כתוצאה ממשקעי חלבון יכול להיות מאוחסן לניתוח מאוחר יותר. Supernatant מצעד שעובר מיצוי נוזל נוזל באמצעותמים וממס אורגני חזק כדי להפריד את התרכובות הידרופילי והידרופובי. ברגע שמופרד, שכבת הידרופילי יכולה להיות מעובד לצורך הניתוח מאוחר יותר או שהושלכה אם אין צורך. החלק הידרופובי מטופל נוסף עם סדרה של ממסים בשלושה צעדי חילוץ מוצק שלב כדי להפריד אותו לחומצות שומן, שומנים ניטראליים, ופוספוליפידים. זה מאפשר לטכנאי את הגמישות לבחור איזה סוג של תרכובות עדיפים לניתוח. זה גם מסייע בזיהוי המטבוליט אמין יותר שכן חלק הידע של כיתה כימית קיימת.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis at JoVE.com

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

TAPE: דבק עוצר דמום אורגני בהשראת תרכובת ניכרת בכל היבט של צמחים עבור יישום כירורגי

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...