Name: in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

ההדמיה בוצעה על מיקרוסקופ confocal זקוף Leica SP5 ממוקם בתוך מתקן FILM של Imperial College בלונדון, המנוהל על ידי ד&quot;ר מרטין Spitaler. בעל הדגימה וכיסוי הראש נעשה בשיתוף פעולה עם המחלקה להנדסה הכימית של Imperial College בלונדון, עם עצות מסמואל ג&#39;ונס וד&quot;ר סיימון Schultz. ניקולה Ruivo, פרנסיסקו דיאז וצוות הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה בImperial College סייעו לסיועם ועצות על גידול בעלי עכבר. מארק סקוט ממומן על ידי HFSP וקולנוע, Olufolake Akinduro ידי CRUK וכריסטינה Lo סלסו ידי CRUK, KKLF, BBSRC וHFSP.

<ol>
	<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hematopoietic+Stem+Cell+Niche+at+a+Glance.">The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Wang, L. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Niches+in+the+Origination+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).</li><li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+the+Spleen+Colony-forming+Cell+and+the+Hematopoietic+Stem+Cell.">The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell.</a> Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).</li><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+Between+Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Fibers.">Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers.</a> Development. 109 (4), 943-952 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+Cells+Reside+in+the+Bulge+Area+of+Pilosebaceous+Unit:+Implications+for+Follicular+Stem+Cells,+Hair+Cycle,+and+Skin+Carcinogenesis.">Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis.</a> Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).</li><li>Doetsch, F., Caill&#233;, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+Zone+Astrocytes+are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Calcium+Signalling+Using+Genetically+Targetable+Fluorescent+Indicators.">Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Cellular+Imaging+Pinpoints+the+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Early+Steps+of+Adult+Hematopoietic+Reconstitution.">In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Specialized+Bone+Marrow+Endothelial+Microdomains+for+Tumour+Engraftment.">In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+Tracking+of+Individual+Haematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+in+their+Niche.">Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Functional+Haematopoietic+Stem+Cell+Niche+Using+Real-time+Imaging.">Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging.</a> Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).</li><li>K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Cellular+Dynamics+and+Endosteal+Location+of+Aged+Early+Hematopoietic+Progenitor+Cells+Revealed+by+Time-lapse+Intravital+Imaging+in+Long+Bones.">Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones.</a> Blood. 114 (2), 290-298 (2009).</li><li>Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Pattern+Coding+of+Sensory+Information+by+Climbing+Fibre-evoked+Calcium+Signals+in+Networks+of+Neighboring+Cerebellar+Purkinje+Cells.">Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells.</a> J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).</li><li>Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Transplanted+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Mouse+Calvarium+Bone+Marrow.">In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow.</a> Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs).">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Seeing+to+Believing:+Labelling+Strategies+for+in+vivo+Cell-tracking+Experiments.">From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+Bone,+Hemopoietic+Stem+Cells+and+Vasculature.">The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Nombela-Arrieta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+of+Haematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cell+Localization+and+Hypoxic+Status+in+the+Bone+Marrow+Microenvironment.">Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).</li></ol>

There is nothing to disclose.

מה שהושג? הפרוטוקול עושה שימוש בהדמיה רב ממדית זמן לשגות כדי לפקח על ההגירה של FACS המטוהרים, vivo לשעבר HSPCs שכותרתו, הושתל במח עצם calvarial עכבר. זיהוי של תאים מושתלים יחידים הושג ואלה היו במעקב לאורך תקופות ממושכות של זמן (שעות) ברמת דיוק גבוהה. חפצי תנועה מושרה נשימה כבר ממוזערים ותאים כבר reimaged שוב ושוב על פני זמן ממושך, כמובן. מה הם כיוונים עתידיים? פיתוח של הטכניקה יכול להתקדם לעבר ניסויי התאוששות כדי לאפשר הדמיה בימים מרובים, במהלך שבוע או יותר ושימוש בהרדמת גז כגון isoflurane לקצר ולפשט את תהליך ההתאוששות לעכבר (הערה: ניסויי התאוששות דורשים אך ורק תנאים סטריליים ניתוח וניהול של משככי כאבים מתאימים). Development של צבע צבעים גדולים יותר של צבעי in vivo, כמו גם תיוג גנטי יעיל של תאי hematopoietic גם יקל על ניסויים רב תיוג, מספק תובנה רבה יותר על תאי תאי אינטראקציות בתוך מח העצם ומאפשר לניסויים מורכבים יותר בעתיד. בנוסף, תיוג בו זמנית של מבני מח עצם מרובים ורכיבי סטרומה יספק תמונה של האירועים המתרחשים בנישות HSPC מלאה יותר. יציבות תמונה של הזמן לשגות סרטים יכולה להיות שיפור preacquisition ידי ייצוב מיקרוסקופ נוסף, כמו גם צמצום הדרגתיים בטמפרטורה במדגם וpostacquisition על ידי שימוש באלגוריתמי רישום תמונה. מגבלות: הטכניקה המתוארת מציגה כמה מגבלות. הישרדות של עכברים לאחר מתן הרדמה בזריקות היא בלתי צפויה והיא קלה מאוד לסיבוכים ניסיון תלוי בתגובת אדם להרדמה. בדרך כלל, זמן רב יותר פגישת הדמיה, קשה יותר הוא לעכבר כדי להתאושש מהרדמה ולכן חשוב לתכנן בקפידה אם העכבר הוא להיות התאושש, באופן אידיאלי הגבלת משך הזמן של הדמיה הזמן לשגות. השימוש בהרדמה בזריקות מגבילה את הזמן בכל פגישת הדמיה יכולה להימשך. למרות זאת, ניתן להאריך את ההרדמה על ידי readministering מינון קטן יותר של חומר הרדמה, שקשה לבצע את זה בצורה מדויקת ומינון יתר העכבר הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר לסיום המוקדם של ההדמיה in vivo. ההרדמה גז היא פחות רעילה ומאפשרת לפגישת הדמיה ראשונית ארוך יותר, אולם התאוששות מהירה של העכבר לאחר&gt; 2 שעות ממשל של isoflurane ארוך הוא מוצלח רק לעתים נדירות. מגבלה נוספת של הטכניקה היא ברזולוציה המוגבלת של התמונות שניתן להשיג במהלך הדמיה הזמן לשגות ריבוי נקודות, כתוצאה מהצורך לרכוש תמונות במהירות. זה, בשילוב עם סחף או שדה מוקדי קופץ (דיסקussed לעיל), יכול לעשות מעקב של תאים קשים. השוואה עם שיטות חלופיות: HSPCs בדרך כלל מסומנים עם צבע lipophilic עשה, אבל צבעי דיר וDiI חלופות שווי ערך וניתן להשתמש בם כל עוד מספיק בהירים צבעי תא אחרים, כפי שנסקר ב[ 16]. למרות תיוג vivo לשעבר של תאים עם עשה הוכח שלא משפיע על התפקוד לטווח הארוך של HSCs, יש לו את המגבלה שעשתה (או כל צבע כימי אחר) בדילול מלא על חלוקת תא. מאז HSCs להתרבות בימים הראשונים שלאחר השתלה, יחס האות לרעש לתאים אלה במהירות מתדרדרת. תיוג אנדוגני של תאים באמצעות מניפולציה וביטוי של חלבוני ניאון גנטיים הוא שיטה חלופית בת קיימא, כל עוד חלבוני הניאון באים לידי ביטוי ברמות גבוהות מספיק כדי ליצור אות לזיהוי דרך עצם הגולגולת. ישנם מספר של techn החלופיiques זמין לביצוע הדמיה של HSPCs בתוך חלל מח עצם, כל אחד עם מגבלות יתרונות שלהם ו. החדרה של מכשירי הדמיה מבוססת סיבים אופטיים אפשרה להדמיה של הכינון מחדש של מח עצם בעצמות [8] ארוכות, תוך ההדמיה confocal לאחר חשיפה כירורגית של עצם השוק והדילול של אמייל עצם עם מקדחה כירורגית [12] פיק תמונות מפורטות של HSPCs המתגורר ב אזורי פריפריה של עצמות ארוכות. שיטות אלה עם זאת הן הרבה יותר חודרניים מזו שתוארה כאן ולכן אינו מאפשרת לחזור על פגישות הדמיה מתמקדות באותו האזור במח עצם באותו העכבר. יתר על כן, זה אפשרי, כי טכניקות אלה עשויות להשפיע על התאים שנצפו ניתנה תגובה בלתי נמנעת לפגיעה נרחבת ברקמה הסובבת. HSPCs כבר צילם לתקופות קצרות של זמן באמצעות coverslips ממוקם מעל, עצמות ירך נכרת שבורות [11], אולם ההשפעה של הכנה קשה זו של הרקמה על HSPCs אינה קליאהr והטכניקה היה בשימוש באופן ייחודי כדי להשיג תצפיות נקודת זמן אחת. עצמות קבועים כבר מחולק למקטעים סדרתי, מוכתמת, והתמונות שהתקבלו שחזרו למודל 3D, מתן פתרון 3D מצוין, במיוחד כאשר יציקות כלי דם נמצאות בשימוש [17], ולאחרונה סריקת הלייזר Cytometry (LaSC) נעשה שימוש כדי להשיג כמותיים צעדים על HSPCs באתר, מודגש על ידי immunostaining [18] אך אינם מסוגלים לספק כל מידע זמני על התנהגות התאים. הטכניקות מתוארות בטכניקה חדשה זו מספקות שילוב של רזולוציה טובה ב3D, דגימה זמנית מספיק לניטור תאי 4D והם יחסית לא פולשנית, ולכן מציעים גישה אידיאלית להשגת ניטור ארוך טווח של HSPCs אינטראקציה עם מח העצם microenvironment.

למרות נישות של תאי גזע שהוכרו במשך עשרות שנות 3 וגם מאופיינות ברקמות רבות כגון הנורה חוש הריח, סיבי שריר, בליטת זקיק שיער או אזור subventricular CNS 4-7, יחסי הגומלין בין תאי גזע hematopoietic (HSCs) וmicroenvironment מח עצם ( BM) עדיין לא נחקר מספיק בשל הקושי של ישירות התבוננות תאים בודדים דרך העצם, כמו גם את הטבע מאוד נוזל של הרקמה עצמה. הוכח, באמצעות מספר המחקרים התפקודיים המבוסס על ablating או overexpressing גנים מסוימים באו HSCs או תאי סטרומה של microenvironment עצמו, שרשת סבוכה סוגי תאים שונים ואותות רגולציה של אחראית להסדרת האיזון העדין בין quiescence , התפשטות, התרחבות והתמיינות של HSCs 1-2. Crosstalk בין HSCs והנישות שלהם ניתן להבין לעומק רק באמצעות תצפית ישירה. זה ACHתודה ievable לפיתוח פרוטוקולי הדמיה מתקדמות, המשלבת את הטכנולוגיה זמינה לא רק במונחים של מיקרוסקופיה, אלא גם של פתרונות בעל דגימה ושל תוכנת רכישה. הדמיה חיה רזולוציה תא בודדת של תאים מושתלים hematopoietic גזע ואב (HSPCs) בתא BM של עצמות calvaria העכבר הראתה כי HSPCs engrafting למקם בקרבתו של כלי SDF-1 וVCAM-1-חיוביים 8-9 ושתאים לא בוגרים יותר נמצאים בתוך 15 - 20 מיקרון מתאי osteoblastic GFP החיובי (קו Col2.3-GFP מהונדס עכבר, שבו יזם 1α קולגן מוגבל תא העצם מניע ביטוי של GFP) ואילו הצאצאים שלהם הם יותר דיסטלי 10. תצפיות דומות התקבלו מעצמות ירך גזורים ושבורות 11 ומעצמות tibeal דלילים 12. הדמיה של מח עצם calvarial נשארת הגישה פולשנית לפחות כדי להשיג הדמיה ישירה של HSPCs בתוך הmicroenvironment ילידי Eir. עם כל הדמיה דוגמא חיה יש צורך מהותי כדי לשמור על המדגם בשקט ככל האפשר, כדי למנוע כל חפצים מיותרים בשל תנועת מדגם. נשימה גורמת לתנודות מטוטלת של ראש העכבר, אשר צריכה להימנע כאשר ההדמיה מח עצם calvarial. מחזיקי stereotactic קונבנציונליים, משמשים למשל להדמיה מוחית ואלקטרופיזיולוגיה, אינם מתאימים להדמית calvarium כי הם חוסמים את העצמות הקדמיות. החל מ בעל עכבר להשתמש כדי למזער את המצוקה במהלך בדיקות הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה חיות 13, בעל 2 רכיב פותח, עם חתיכה קטנה קבועה לראש של העכבר כדי ליצור חלון הדמיה מחובר לזרוע גדולה יותר להבטיח אחיזה יציבה עם צלחת בסיס כבדה המבטיחה בחוזקה לבמת מיקרוסקופ. אבטחת החתיכה לגולגולת של עכבר הראש מאפשרת נשימה חופשית ועדיין לשתק את הראש במקום וכראוי ביטול מ &#39;ovements עקב נשימה. מנגנון &quot;נעילה ומפתח&quot; המקשר את ראש החלקים לגוף המחזיק מאפשר הגודל של החלון כדי למזער כמו גם דיוק מוגבר של מיצוב, ולכן לפשט את הניתוח, ואת ההתאמה של צלחת הבסיס לבמה מאפשר יישור מדויק על המיקרוסקופ. כדי לפקח באופן מדויק תאי ניעתי, פרוטוקול הזמן לשגות ריבוי נקודות נועד לאפשר מעקב של תאים לאורך זמן עם 5 דקות במרווחים בין נקודות זמן. HSCs כאן, עשה שכותרתו הזריק לעכברי כתב osteoblasitc col2.3GFP 10,14 וצלם כ 20 שעה מאוחר יותר. בעל העכבר שתוכנן והגדרות ההדמיה הנדרש לביצוע הדמיה הזמן לשגות מהירה ריבוי נקודות של אותם האזורים על פני תקופה של שעות מרובות מתוארות בפירוט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

באמצעות איזון עדין בין קפאון ושגשוג, התחדשות עצמית וייצור של צאצאי הבדיל, תאי גזע hematopoietic (HSCs) לשמור על מחזור של כל שושלות תאי דם הבוגרים. התיאום של האותות המורכבים המובילים לגורל HSC ספציפי נשען על האינטראקציה בין HSCs וmicroenvironment המורכב מח עצם, שעדיין הוא הבין היטב [1-2]. אנו מתארים כיצד על ידי שילוב של בעל דגימה חדש שפותח עבור מיצוב בעלי חיים יציב עם confocal רב שלבים ושני פוטונים בטכניקות ההדמיה vivo, ניתן להשיג ערימות ברזולוציה גבוהה 3D המכילות HSPCs ונישות המקיפות ולפקח עליהם לאורך זמן באמצעות הדמיה הזמן לשגות ריבוי נקודות. הדמיה בחדות גבוהה מאפשרת לתאי איתור vivo לשעבר שכותרת hematopoietic גזע ואב (HSPCs) המתגוררים בתוך מח העצם. יתר על כן, הדמיה 3D הזמן לשגות ריבוי נקודות, obtained עם הגדרות רכישה מהירות יותר, מספק מידע מדויק על תנועת HSPC והאינטראקציות ההדדיות בין HSPCs ותאי סטרומה. מעקב של HSPCs ביחס לתאי osteoblastic GFP החיובי מוצג כיישום למופת של שיטה זו. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת כדי לעקוב אחר כל תא hematopoietic או סטרומה שכותרתו כראוי של עניין בתוך חלל מוח עצם calvarium העכבר.

המנהג עשה, בעל עכבר דיוק גבוה כוללים חלון הדמיה calvarium מאפשר הדמיה ממושכת של HSPCs FACS המטוהר, שכותרתו הזריק לעכברים קטלני המוקרנים נמען (איור 1 א). בדרך כלל, לאחר ההזרקה של בין 15-20,000 תאים שכותרתו, 8 עד 15 תאים הם בדרך כלל מוכרים בתחום ההדמיה מח עצם של גולגולת היום הבא. כאן הוא הראה כיצד לרכוש ערימות 3D רזולוציה תא בודדות של HSPC המכיל אזורי מח עצם של כ 90 - 120 עובי מיקרומטר, (איור 1), ואחריו זמן לשגות סרטי 4D של HSPCs זוהה (איור 1 ג וסרט). תוצאות שאינן אופטימליות מתקבלות אם מלט השיניים אינו ערוך בצורה אופטימלית, למשל המים יכולים לדלוף מאזורים אטומים שאינם, ועל אף שניתן עקף מהחלק העליון של בעלה, כל תקופת הזמן שבה העדשה לא טבלה לתוך מים מוביל לf השחורה<html> Rames. להיסחף קצת בתמונות הוא בלתי נמנע בשל התפשטות תרמית של החומרים של בעל העכבר, אולם ניתן מודגש על ידי הידבקות בטון הכי מוצלחת, שהובילו לניתוק הדרגתי של העכבר, ועל ידי הפרעות של ההדמיה להגדיר, שמוביל לקפיצות פתאומיות של המוקד במהלך הדמיה הזמן לשגות. הסחף במהלך הדמיה הזמן לשגות ריבוי נקודות יכול להיגרם גם על ידי אי דיוקים בתנועות השלב שבו בוחנים מחדש את העמדות צילמו בעבר. חפצי דריפט וגמגום בזמן לשגות סרטים ניתן לתקן על ידי שימוש באלגוריתמי רישום תמונה. שולחן עירור 1 והגדרות פליטה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="width:204px;"> צבע ערוץ </td><td style="width:213px;"> עירור </td><td style="width:208px;"> פליטה </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 ננומטר </td><td style="width:208px;"> 500-530 ננומטר </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Autofluorescence </td><td style="width:213px;"> 543 ננומטר </td><td style="width:208px;"> 560-610 ננומטר </td></tr><tr><td style="width:204px;"> עשיתי </td><td style="width:213px;"> 633 ננומטר </td><td style="width:208px;"> 640-700 ננומטר </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 ננומטר (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 ננומטר </td></tr></tbody></table><img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1 בהדמית 4D vivo של HSPCs בcalvarium עכבר. תאי דוגמאות לתוצאות שהתקבלו (ב &#39;) פרוסות 2D מערימת 3D (עומק כולל הוא 114 מיקרומטר), המכילה אות מעצם קולגן (לבן), עשה שכותרתו (אדומה) - מתאר () של הניסוי (C B).. , Cel autofluorescentls (צהוב) ותאי osteoblastic (ירוק). ברים סולם: 100 מיקרומטר פרוסות (C) 2D מסרט 4D הזמן לשגות מראה HSC (אדום) עשה שכותרתו הנודד בקרבת תאי osteoblastic (ירוק).. הקו המקווקו מדגיש את התזוזה של התא. ברים סולם: 50 מיקרומטר (B) ו100 מיקרומטר (C). הערה:. הסרט המתקבל מרכישת הזמן לשגות ב( C) מוצג במאמר וידאו <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...