Name: in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00
Duration: 12 min 54 s
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इमेजिंग डॉ मार्टिन Spitaler द्वारा प्रबंधित इंपीरियल कॉलेज लंदन के फिल्म की सुविधा के भीतर स्थित एक ईमानदार Leica SP5 confocal खुर्दबीन पर बाहर किया गया था. नमूना धारक और बुद्धि शमूएल जोन्स और डॉ साइमन Schultz से सलाह के साथ, इंपीरियल कॉलेज लंदन के केमिकल इंजीनियरिंग विभाग के सहयोग से बनाया गया था. निकोला Ruivo, फ्रांसिस्को Diaz और इंपीरियल कॉलेज में सीबीएस स्टाफ माउस पशुपालन पर उनकी सहायता और सलाह के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. मार्क स्कॉट CRUK, KKLF, बीबीएसआरसी और HFSP द्वारा CRUK और क्रिस्टीना लो सेलसो द्वारा HFSP और फिल्म, Olufolake Akinduro द्वारा वित्त पोषित है.

<ol>
	<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hematopoietic+Stem+Cell+Niche+at+a+Glance.">The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Wang, L. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Niches+in+the+Origination+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).</li><li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+the+Spleen+Colony-forming+Cell+and+the+Hematopoietic+Stem+Cell.">The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell.</a> Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).</li><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+Between+Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Fibers.">Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers.</a> Development. 109 (4), 943-952 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+Cells+Reside+in+the+Bulge+Area+of+Pilosebaceous+Unit:+Implications+for+Follicular+Stem+Cells,+Hair+Cycle,+and+Skin+Carcinogenesis.">Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis.</a> Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).</li><li>Doetsch, F., Caill&#233;, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+Zone+Astrocytes+are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Calcium+Signalling+Using+Genetically+Targetable+Fluorescent+Indicators.">Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Cellular+Imaging+Pinpoints+the+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Early+Steps+of+Adult+Hematopoietic+Reconstitution.">In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Specialized+Bone+Marrow+Endothelial+Microdomains+for+Tumour+Engraftment.">In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+Tracking+of+Individual+Haematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+in+their+Niche.">Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Functional+Haematopoietic+Stem+Cell+Niche+Using+Real-time+Imaging.">Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging.</a> Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).</li><li>K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Cellular+Dynamics+and+Endosteal+Location+of+Aged+Early+Hematopoietic+Progenitor+Cells+Revealed+by+Time-lapse+Intravital+Imaging+in+Long+Bones.">Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones.</a> Blood. 114 (2), 290-298 (2009).</li><li>Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Pattern+Coding+of+Sensory+Information+by+Climbing+Fibre-evoked+Calcium+Signals+in+Networks+of+Neighboring+Cerebellar+Purkinje+Cells.">Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells.</a> J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).</li><li>Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Transplanted+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Mouse+Calvarium+Bone+Marrow.">In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow.</a> Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs).">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Seeing+to+Believing:+Labelling+Strategies+for+in+vivo+Cell-tracking+Experiments.">From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+Bone,+Hemopoietic+Stem+Cells+and+Vasculature.">The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Nombela-Arrieta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+of+Haematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cell+Localization+and+Hypoxic+Status+in+the+Bone+Marrow+Microenvironment.">Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).</li></ol>

There is nothing to disclose.

क्या पूरा किया गया? प्रोटोकॉल माउस calvarial अस्थि मज्जा में शुद्ध FACS के प्रवास, पूर्व vivo लेबल, प्रतिरोपित HSPCs नजर रखने के लिए समय चूक बहु आयामी इमेजिंग का उपयोग करता है. एकल प्रतिरोपित कोशिकाओं की पहचान हासिल किया गया है और इन उच्च सटीकता के साथ समय (मानव संसाधन) की लंबे समय से अधिक नजर रखी जा चुके हैं. श्वास प्रेरित आंदोलन कलाकृतियों को कम से कम किया गया है और कोशिकाओं को बार बार एक लंबे समय के पाठ्यक्रम से अधिक reimaged किया गया है. भविष्य दिशाओं क्या हैं? तकनीक के विकास को छोटा और नोट (माउस के लिए वसूली की प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए एक सप्ताह या उससे अधिक है और ऐसे isoflurane के रूप में गैस anesthetics के उपयोग के दौरान, कई दिनों पर इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए वसूली प्रयोगों की दिशा में प्रगति कर सकते हैं: वसूली प्रयोगों सख्ती की आवश्यकता बाँझ सर्जरी की स्थिति और उपयुक्त दर्दनाशक दवाओं के प्रशासन). देवएक vivo में रंगों का बड़ा रंग पैलेट के साथ ही इसके अलावा, बहु लेबलिंग प्रयोगों की सुविधा अस्थि मज्जा के भीतर सेल सेल बातचीत में और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं और भविष्य में और अधिक जटिल प्रयोगों के लिए अनुमति देगा hematopoietic कोशिकाओं के कुशल आनुवंशिक लेबलिंग के elopment. साथ ही, कई अस्थि मज्जा संरचनाओं और स्ट्रोमा घटकों के एक साथ लेबलिंग HSPC आलों में हो रही घटनाओं की एक और पूरी तस्वीर प्रदान करेगा. समय चूक फिल्मों की छवि स्थिरता माइक्रोस्कोप स्थिर आगे के रूप में अच्छी तरह से छवि पंजीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके नमूना और postacquisition में तापमान ढ़ाल कम करके पूर्व अधिग्रहण सुधार किया जा सकता है. सीमाएं: वर्णित तकनीक कुछ सीमाएँ प्रस्तुत करता है. इंजेक्शन anesthetics के प्रशासन के बाद चूहों की जीवन रक्षा अप्रत्याशित है और इसे करने के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रिया के आधार पर अनुभव जटिलताएं बहुत आसान हैसंवेदनाहारी. माउस संज्ञाहरण से उबरने के लिए और यह माउस आदर्श समय चूक इमेजिंग की अवधि सीमित बरामद किया है अगर ध्यान से योजना के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है के लिए आम तौर पर, एक इमेजिंग सत्र अब, मुश्किल है. इंजेक्शन anesthetics का उपयोग प्रत्येक इमेजिंग सत्र के लिए पिछले सकता है समय सीमा. यह संवेदनाहारी की एक छोटी खुराक readministering द्वारा संज्ञाहरण लम्बा संभव है, यह मुश्किल यह सही और माउस overdosing में vivo इमेजिंग की समयपूर्व समाप्ति की सबसे लगातार कारणों में से एक है प्रदर्शन है. Isoflurane के&gt; 2 घंटा लंबा प्रशासन शायद ही कभी सफल होने के बाद गैस संज्ञाहरण माउस की लेकिन तेजी से वसूली, कम विषाक्त है और एक लंबे समय तक प्रारंभिक इमेजिंग सत्र के लिए अनुमति देता है. तकनीक की एक और सीमा की वजह से तेजी से छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यकता के लिए, बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग के दौरान प्राप्त की जा सकती है कि छवियों के सीमित संकल्प है. फोकल बहाव या क्षेत्र के साथ मिलकर यह, (डिस्क कूदता) ऊपर ussed, कोशिकाओं की ट्रैकिंग कठिन बना सकते हैं. वैकल्पिक तरीकों के साथ तुलना करें: HSPCs आमतौर पर किया lipophilic डाई के साथ चिह्नित कर रहे हैं, लेकिन [16] में समीक्षा के रूप में दीर और DiI रंजक, बराबर विकल्प और अन्य सेल रंजक के रूप में लंबे समय के रूप में पर्याप्त उज्ज्वल इस्तेमाल किया जा सकता हैं. कोशिकाओं के पूर्व vivo लेबलिंग के साथ HSCs के दीर्घकालिक कार्य प्रभावित नहीं दिखाया गया है किया है, भले ही यह कोशिकाओं के विभाजन पर पतला है था कि सीमा (या किसी भी अन्य रासायनिक डाई) है. HSCs प्रत्यारोपण के बाद पहले दिन के दौरान पैदा करना, इन कोशिकाओं के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत तेजी से कमजोर होती जाती है. आनुवंशिक हेरफेर और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से कोशिकाओं की अंतर्जात लेबलिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से पता लगाने योग्य संकेत उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं के रूप में लंबे समय के रूप में, एक व्यवहार्य विकल्प विधि है. वैकल्पिक techn के एक नंबर रहे हैंउपलब्ध iques अपने स्वयं के लाभ और सीमाओं के साथ, अस्थि मज्जा अंतरिक्ष के भीतर प्रत्येक HSPCs की इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए. Confocal इमेजिंग एक शल्य ड्रिल के साथ टिबिया और हड्डी तामचीनी के thinning की शल्य प्रदर्शन के बाद, जबकि फाइबर ऑप्टिक आधारित इमेजिंग उपकरणों की निवेशन, लंबी हड्डियों [8] में अस्थि मज्जा पुनर्गठन की इमेजिंग के लिए अनुमति दी [12] HSPCs में रहने के विस्तृत चित्र का उत्पादन लंबी हड्डियों की परिधीय क्षेत्रों. हालांकि इन तरीकों में कहीं अधिक आक्रामक यहाँ वर्णित है और इसलिए एक ही माउस के भीतर एक ही अस्थि मज्जा क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित इमेजिंग सत्र दोहराने की अनुमति नहीं देते हैं एक से हैं. इसके अलावा, यह इन तकनीकों आसपास के ऊतकों में व्यापक क्षति के लिए अपरिहार्य प्रतिक्रिया दी मनाया कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है कि संभव है. HSPCs excised, खंडित femurs [11] पर रखा coverslips के माध्यम से समय का संक्षिप्त अवधि के लिए imaged किया गया है, HSPCs पर ऊतक के इस कठोर तैयारी की लेकिन प्रभाव clea नहीं हैअनुसंधान और तकनीक ही समय बिंदु टिप्पणियों प्राप्त करने के लिए विशिष्ट इस्तेमाल किया गया था. फिक्स्ड हड्डियों दाग, धारावाहिक वर्गों में sectioned, और प्राप्त छवियों संवहनी डाले उपयोग किया जाता है, खासकर जब उत्कृष्ट 3 डी संकल्प, उपलब्ध कराने, एक 3 डी मॉडल में खंगाला गया है [17], और हाल ही में लेजर स्कैनिंग Cytometry (LaSC) मात्रात्मक प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है बगल में HSPCs के बारे में उपाय, [18] immunostaining से प्रकाश डाला लेकिन कोशिकाओं के व्यवहार के बारे में कोई अस्थायी जानकारी प्रदान करने में असमर्थ हैं. इस नई तकनीक में वर्णित तकनीकों 4D में कोशिकाओं की निगरानी के लिए 3 डी में अच्छा संकल्प, पर्याप्त लौकिक नमूने का एक संयोजन प्रदान करते हैं और वे इसलिए अस्थि मज्जा के साथ बातचीत HSPCs की लंबे समय तक निगरानी प्राप्त करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण की पेशकश, अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव हैं microenvironment.

स्टेम सेल आलों ऐसे घ्राण बल्ब, मांसपेशी फाइबर, बाल कूप उभार या सीएनएस subventricular क्षेत्र 4-7 के रूप में दशकों 3 के लिए मान्यता प्राप्त है और अच्छी तरह से कई ऊतकों में विशेषता गया होने के बावजूद, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (HSCs) और अस्थि मज्जा microenvironment के बीच बातचीत ( बी एम) अभी भी खराब होने के कारण सीधे हड्डी के माध्यम से एकल कक्षों के साथ ही ऊतक के ही अत्यंत तरल पदार्थ प्रकृति के अवलोकन की कठिनाई को समझ रहे हैं. यह विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और विनियामक संकेतों की एक जटिल नेटवर्क निष्क्रियता के बीच नाजुक संतुलन को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है कि, ablating या HSCs या microenvironment खुद की stromal कोशिकाओं या तो में विशिष्ट जीन overexpressing पर आधारित कार्यात्मक अध्ययन का एक नंबर के माध्यम से दिखाया गया है , प्रसार, विस्तार और HSCs 1-2 से भेदभाव. HSCs और उनके आलों बीच crosstalk केवल प्रत्यक्ष अवलोकन के माध्यम से गहराई में समझा जा सकता है. इस ACH हैन केवल माइक्रोस्कोपी के संदर्भ में उपलब्ध प्रौद्योगिकी के संयोजन उन्नत इमेजिंग प्रोटोकॉल के विकास के लिए ievable धन्यवाद, लेकिन यह भी नमूना धारक समाधान की और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की. माउस calvaria हड्डियों के बीएम डिब्बे में प्रत्यारोपित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) की एकल कोशिका संकल्प रहते इमेजिंग engrafting HSPCs अधिक अपरिपक्व कोशिकाओं एसडीएफ -1 और Vcam -1 पॉजिटिव जहाजों 8-9 की निकटता में और उस के स्थानीयकरण से पता चला कि उनकी संतान 10 अधिक बाहर हैं, जबकि GFP पॉजिटिव osteoblastic कोशिकाओं (अस्थिकोरक प्रतिबंधित कोलेजन 1α प्रमोटर GFP अभिव्यक्ति ड्राइव जिसमें Col2.3-GFP ट्रांसजेनिक माउस लाइन,) से 20 माइक्रोन - 15 के भीतर पाए जाते हैं. इसी प्रकार टिप्पणियों विच्छेदित और खंडित फीमर हड्डियों 11 से और पतला tibeal हड्डियों 12 से प्राप्त किया गया. Calvarial अस्थि मज्जा की इमेजिंग वें भीतर HSPCs के प्रत्यक्ष दृश्य प्राप्त करने के लिए कम से कम इनवेसिव दृष्टिकोण रहता हैEIR देशी microenvironment. किसी भी जीवित नमूना इमेजिंग के साथ होने के कारण नमूना आंदोलन को किसी भी अनावश्यक कलाकृतियों से बचने के लिए संभव के रूप में अभी भी नमूना रखने के लिए एक अंतर्निहित जरूरत नहीं है. श्वास calvarial अस्थि मज्जा इमेजिंग जब से परहेज करने की आवश्यकता है जो माउस सिर की oscillatory आंदोलनों का कारण बनता है. वे ललाट हड्डियों में बाधा डालती है क्योंकि मस्तिष्क इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया परम्परागत स्टीरियोटैक्टिक धारकों, calvarium इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं. लाइव इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पढ़ाई 13 के दौरान संकट को कम करने के लिए इस्तेमाल एक माउस धारक से शुरू, एक 2 घटक धारक एक साथ स्थिर पकड़ सुनिश्चित करने के लिए एक बड़ा हाथ से जुड़ा एक इमेजिंग खिड़की बनाने के लिए माउस के सिर के लिए तय एक छोटा सा टुकड़ा के साथ विकसित किया गया था खुर्दबीन मंच में मजबूती से सुरक्षित करता है, जो भारी बेस प्लेट. अभी भी जगह में सिर immobilizing और पर्याप्त रूप से मीटर को नष्ट करते हुए माउस की खोपड़ी के लिए सिर टुकड़ा सुरक्षित मुक्त सांस लेने की अनुमति देता हैसाँस लेने के कारण ovements. धारक शरीर को सिर टुकड़ा जोड़ने ए &#39;ताला और चाबी&#39; तंत्र खिड़की के आकार इसलिए सर्जरी सरल बनाने, स्थिति की वृद्धि की सटीकता के साथ ही कम से कम करने की अनुमति देता है, और चरण में बेस प्लेट के फिट माइक्रोस्कोप पर सटीक संरेखण के लिए अनुमति देता है. सही रूप में गतिशील कोशिकाओं की निगरानी करने के लिए, एक बहु बिंदु समय व्यतीत प्रोटोकॉल समय बिंदुओं के बीच 5 मिनट के अंतराल के साथ समय के साथ कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति के लिए डिजाइन किया गया था. इधर, लेबल किया HSCs col2.3GFP osteoblasitc संवाददाता चूहों 10,14 में इंजेक्शन और लगभग 20 घंटे बाद imaged हैं. डिजाइन किया गया था और कई घंटे की अवधि में एक ही क्षेत्रों का तेजी से बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक इमेजिंग सेटिंग्स विस्तार से वर्णन किया गया हैं कि माउस धारक.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

निष्क्रियता और प्रसार, आत्म नवीकरण और भेदभाव संतान के उत्पादन के बीच एक नाजुक संतुलन के माध्यम से, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (HSCs) सभी परिपक्व रक्त कोशिका प्रजातियों के कारोबार को बनाए रखने. विशिष्ट एचएससी भाग्य के लिए अग्रणी जटिल संकेतों के समन्वय HSCs और अभी भी खराब समझा जाता है जो जटिल अस्थि मज्जा microenvironment, [1-2] के बीच बातचीत पर निर्भर करता है. हम बहु कदम confocal और vivo इमेजिंग तकनीक में दो फोटॉन साथ स्थिर जानवर स्थिति के लिए एक नव विकसित नमूना धारक के संयोजन से, यह उच्च संकल्प 3 डी HSPCs युक्त ढेर और उनके आसपास के आलों प्राप्त करने के लिए और समय के साथ उन पर नजर रखने के लिए संभव है वर्णन कैसे बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग के माध्यम से. उच्च परिभाषा इमेजिंग का पता लगाने के पूर्व vivo लेबल hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) अस्थि मज्जा के भीतर रहने की अनुमति देता है. इसके अलावा, बहु बिंदु समय चूक 3 डी इमेजिंग, ओतेजी से अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ btained, HSPC आंदोलन और HSPCs और स्ट्रोमा कोशिकाओं के बीच पारस्परिक संबंधों के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करता है. GFP सकारात्मक osteoblastic कोशिकाओं के संबंध में HSPCs की ट्रैकिंग इस पद्धति का एक अनुकरणीय आवेदन के रूप में दिखाया गया है. इस तकनीक माउस calvarium अस्थि मज्जा अंतरिक्ष के भीतर ब्याज की किसी भी उचित लेबल hematopoietic या stromal सेल ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

कस्टम, एक calvarium इमेजिंग खिड़की सहित उच्च परिशुद्धता माउस धारक घातक विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों (चित्रा 1 ए) में इंजेक्शन FACS शुद्ध, लेबल HSPCs के लंबे समय तक इमेजिंग की अनुमति देता है. आमतौर पर, 15 के बीच के इंजेक्शन के बाद - 20 हजार लेबल कोशिकाओं, 8 से 15 कोशिकाओं खोपड़ी अगले दिन की अस्थि मज्जा इमेजिंग क्षेत्र के भीतर आम तौर पर स्वीकार करने योग्य हैं. पहचान HSPCs (चित्रा 1C और फिल्म) के 4D समय चूक फिल्मों द्वारा पीछा 120 माइक्रोन मोटाई, (चित्रा 1 बी), - यहाँ यह लगभग 90 की अस्थि मज्जा क्षेत्रों HSPC युक्त के एकल कक्ष संकल्प 3 डी के ढेर प्राप्त करने के लिए कैसे दिखाया गया है. दंत सीमेंट बेहतर तैयार नहीं है अगर suboptimal परिणाम उदाहरण के लिए पानी और यह धारक के ऊपर से ऊपर सबसे ऊपर जा सकता है, भले ही गैर सील क्षेत्रों से रिसाव हो सकता है, प्राप्त कर रहे हैं, किसी भी समय की अवधि में जो लेंस डूबा नहीं है पानी में काले च की ओर जाता है<html> rames. छवियों में कुछ बहाव अचानक छलांग करने के लिए अग्रणी, लेकिन यह माउस के प्रगतिशील टुकड़ी के लिए अग्रणी suboptimal सीमेंट आसंजन द्वारा बल, और स्थापित इमेजिंग के perturbations द्वारा किया जा सकता है, कारण माउस धारक की सामग्री के थर्मल विस्तार करने के लिए अनिवार्य है समय चूक इमेजिंग के दौरान ध्यान देने की. पहले से imaged पदों समीक्षा जब बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग के दौरान बहाव भी मंच आंदोलनों में अशुद्धियों के कारण हो सकता है. समय चूक फिल्मों में बहाव और हकलाना कलाकृतियों छवि पंजीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके के लिए सुधारा जा सकता है. तालिका 1 उत्तेजना और उत्सर्जन सेटिंग्स. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> कलर चैनल </td><td style="width:213px;"> उत्तेजना </td><td style="width:208px;"> उत्सर्जन </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 एनएम </td><td style="width:208px;"> 500-530 एनएम </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Autofluorescence </td><td style="width:213px;"> 543 एनएम </td><td style="width:208px;"> 560-610 एनएम </td></tr><tr><td style="width:204px;"> था </td><td style="width:213px;"> 633 एनएम </td><td style="width:208px;"> 640-700 एनएम </td></tr><tr><td style="width:204px;"> एसएचजी </td><td style="width:213px;"> 840 एनएम (सांसद) </td><td style="width:208px;"> 400-450 एनएम </td></tr></tbody></table><img alt="चित्रा 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> माउस calvarium में HSPCs की विवो 4D इमेजिंग में चित्रा 1. प्रयोग की (ए) को रेखांकित (बी - सी).. प्राप्त परिणामों के उदाहरण (बी) के एक 3 डी ढेर से 2 डी स्लाइस (कुल गहराई 114 मीटर है), मज्जा हड्डी (सफेद) से संकेत युक्त, लेबल किया कोशिकाओं (लाल) , autofluorescent सीईएलरास (पीला) और osteoblastic कोशिकाओं (हरा). स्केल सलाखों:. Osteoblastic कोशिकाओं (हरा) की निकटता में पलायन एक लेबल किया एचएससी (लाल) दिखा एक 4D समय व्यतीत फिल्म से 100 माइक्रोन (सी) 2 डी स्लाइस. बिंदीदार रेखा सेल के विस्थापन पर प्रकाश डाला गया. स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन (बी) और 100 माइक्रोन (सी). नोट:. वीडियो लेख के दौरान दिखाया गया है (सी) में समय चूक अधिग्रहण से प्राप्त फिल्म <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) और अस्थि मज्जा आलों के बीच बातचीत की प्रकृति खराब समझा जाता है. कस्टम हार्डवेयर संशोधनों और एक बहु कदम अधिग्रहण प्रोटोकॉल पूर्व vivo छवि अस्थि मज्जा क्षेत्रों में असर पड़ा लेबल HSPCs, ट्रैकिंग बातचीत और आंदोलन करने के लिए दो photon और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की अनुमति.

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

वयस्क Zebrafish में पूरे गुर्दे मज्जा का प्रत्यारोपण

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

अस्थि मज्जा hematopoietic कोशिकाओं के घर वापस आना

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

अलगाव और वयस्क मानव Endothelial कालोनी बनाने पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

प्ररूपी और murine hematopoietic स्टेम सेल और वंश प्रतिबद्ध progenitors के विश्लेषण से अलगाव

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की विवो Clonal ट्रैकिंग में

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

माउस अस्थि मज्जा से अस्थिशोषक व्युत्पत्ति

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

डायनामिक सेलुलर प्रोट्र्रेशन में प्रोटीन एकाग्रता के सॉफ़्टवेयर-सहायता प्राप्त ट्रैकिंग के लिए एक ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Efflux पंप्स के निषेध के माध्यम से Hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं में Mitochondrial झिल्ली क्षमता के प्रवाह Cytometric आकलन की सटीकता में सुधार

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

वीवो में माउस खोपड़ी बोन मैरो में मेगाकैरियोसाइट्स और प्रोपलेट्स की दो फोटॉन इमेजिंग

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का मूल्यांकन बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...