Name: in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

Изображений проводили на вертикальном Leica SP5 конфокальной микроскопии, расположенного внутри пленки объекту Имперского колледжа в Лондоне, под управлением д-ра Мартина Spitaler. Держатель образца и головной убор был сделан в сотрудничестве с отделом химической технологии Имперского колледжа в Лондоне, при консультации с Сэмюэлем Джонсом и д-р Саймон Шульц. Никола Руиво, Франсиско Диас и персонал КОС в Имперском колледже сыграли важную роль для их помощи и консультаций по мыши хозяйства. Марк Скотт финансируется HFSP, статьи, Olufolake Akinduro по CRUK и Кристина Lo Celso по CRUK, KKLF, BBSRC и HFSP.

<ol>
	<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hematopoietic+Stem+Cell+Niche+at+a+Glance.">The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Wang, L. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Niches+in+the+Origination+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).</li><li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+the+Spleen+Colony-forming+Cell+and+the+Hematopoietic+Stem+Cell.">The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell.</a> Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).</li><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+Between+Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Fibers.">Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers.</a> Development. 109 (4), 943-952 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+Cells+Reside+in+the+Bulge+Area+of+Pilosebaceous+Unit:+Implications+for+Follicular+Stem+Cells,+Hair+Cycle,+and+Skin+Carcinogenesis.">Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis.</a> Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).</li><li>Doetsch, F., Caill&#233;, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+Zone+Astrocytes+are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Calcium+Signalling+Using+Genetically+Targetable+Fluorescent+Indicators.">Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Cellular+Imaging+Pinpoints+the+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Early+Steps+of+Adult+Hematopoietic+Reconstitution.">In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Specialized+Bone+Marrow+Endothelial+Microdomains+for+Tumour+Engraftment.">In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+Tracking+of+Individual+Haematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+in+their+Niche.">Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Functional+Haematopoietic+Stem+Cell+Niche+Using+Real-time+Imaging.">Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging.</a> Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).</li><li>K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Cellular+Dynamics+and+Endosteal+Location+of+Aged+Early+Hematopoietic+Progenitor+Cells+Revealed+by+Time-lapse+Intravital+Imaging+in+Long+Bones.">Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones.</a> Blood. 114 (2), 290-298 (2009).</li><li>Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Pattern+Coding+of+Sensory+Information+by+Climbing+Fibre-evoked+Calcium+Signals+in+Networks+of+Neighboring+Cerebellar+Purkinje+Cells.">Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells.</a> J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).</li><li>Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Transplanted+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Mouse+Calvarium+Bone+Marrow.">In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow.</a> Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs).">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Seeing+to+Believing:+Labelling+Strategies+for+in+vivo+Cell-tracking+Experiments.">From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+Bone,+Hemopoietic+Stem+Cells+and+Vasculature.">The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Nombela-Arrieta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+of+Haematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cell+Localization+and+Hypoxic+Status+in+the+Bone+Marrow+Microenvironment.">Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).</li></ol>

There is nothing to disclose.

Что было достигнуто? Протокол использует многомерную покадровой обработки изображений для мониторинга миграции FACS очищали, Экс Vivo меченые, пересаженные HSPCs в мыши свода черепа костного мозга. Идентификация отдельных трансплантированных клеток был достигнут, и они были контролироваться в течение продолжительного периода времени (час) с высокой точностью. Дыхательные индуцированные артефакты движения были сведены к минимуму и клетки были неоднократно reimaged в течение длительного времени, конечно. Каковы будущие направления? Разработка методики может прогрессировать в сторону экспериментов восстановления для обеспечения визуализации на нескольких дней, в течение недели или более и использования газовых анестетиков, таких как изофлураном сократить и упростить процесс восстановления для мыши (Примечание: эксперименты восстановления требуют строго стерильные условия хирургия и администрация соответствующего анальгетиков). Development большего цветового палитрой красок в естественных условиях, а также эффективного генетического маркирования гемопоэтических клеток также облегчить мульти-маркировки экспериментов, обеспечить более глубокое межклеточных взаимодействий в костном мозге и способствуют созданию более сложных экспериментов в будущем. Кроме того, одновременное маркировка нескольких структур костного мозга и компонентов стромы обеспечит более полную картину событий, происходящих в HSPC ниш. Стабильность изображения из покадровой фильмов может быть улучшена путем стабилизации preacquisition микроскопа дополнительно, а также свести к минимуму температурные градиенты в образце и postacquisition с помощью алгоритмов регистрации изображений. Ограничения: Методика описана представлены некоторые ограничения. Выживание мышей после введения инъекций анестетиков непредсказуема, и это очень легко опыта осложнений в зависимости от индивидуальной реакциианестетик. Вообще, чем дольше сессия изображений, тем труднее для мыши, чтобы оправиться от наркоза и поэтому важно тщательно спланировать, если мышь, подлежащих возмещению, в идеале предельная продолжительность визуализации промежуток времени. Использование инъекций анестетиков ограничивает время каждого сеанса визуализации может длиться. Хотя вполне возможно, продлить анестезию readministering меньшую дозу анестетика, трудно выполнить это точно и передозировки мышь является одним из наиболее частых причин досрочного прекращения визуализации в естественных условиях. Газ анестезия является менее токсичным и позволяет для более начальной сессии изображений, однако быстрое восстановление мыши после&gt; 2 ч долго администрация изофлураном редко успешным. Другим ограничением метода является ограниченное разрешение изображений, которые можно получить во время многоточечного покадровой съемки, в связи с необходимостью приобретения изображения быстро. Это, в сочетании с фокусным дрейфа или поле прыгает (дискussed выше), можно сделать отслеживание клеток трудно. Сравнение с альтернативными методами: HSPCs обычно помечены липофильном красителя сделал, но DIR и DiI красители являются эквивалентными альтернативы и другие красители клеток могут быть использованы до тех пор, достаточно яркий, как отзывы в [16]. Даже при том, что экс естественных маркировка клеток с сделал, как было показано, не влияет на долгосрочный функцию ГСК, он имеет ограничение, что сделал (или любой другой химический краситель) разбавляют при делении клеток. С ГСК размножаться в течение первых дней после трансплантации, отношение сигнал-шум для этих клеток быстро ухудшается. Эндогенный маркировки клеток с помощью генетических манипуляций и экспрессии флуоресцентных белков является хорошей альтернативой метод, при условии, что флуоресцентные белки экспрессируются при достаточно высоких уровнях, чтобы генерировать сигнал детектируемый через кости черепа. Есть ряд альтернативных технiques доступные для выполнения визуализации HSPCs в пространстве костного мозга, каждый со своими преимуществами и ограничениями. Размещение волоконно-оптических устройств на основе изображений позволило визуализации восстановления костного мозга в длинных костей [8], в то время как конфокальной микроскопии после хирургического воздействия на кости и истончение костной эмали с хирургической дрели [12] подготовил подробные изображения HSPCs проживающих в периферийные районы длинных костей. Однако эти методы являются гораздо более агрессивным, чем описанный здесь, и поэтому не позволяют повторить сеансы визуализации упором на той же самой области костного мозга в той же мыши. Более того, вполне возможно, что эти методы могут влиять на клетки, наблюдаемые с учетом неизбежно ответ на значительный ущерб в окружающие ткани. HSPCs были отображены в течение коротких периодов времени через покровные размещенных над подакцизным, сломанных бедер [11], однако влияние этой суровой подготовки ткани на HSPCs не Клеаг и техника использовалась однозначно получить единую точку наблюдения времени. Исправлены кости были подразделяются на серийных срезах, окрашенных, и полученные изображения реконструирован в 3D-модели, обеспечивая превосходное разрешение 3D, особенно когда сосудистые слепки используются [17], а в последнее время лазерного сканирования Cytometry (LASC) был использован для получения количественной меры около HSPCs в месте, подчеркнул иммуноокрашивания [18], но не в состоянии обеспечить любую временную информацию о поведении клеток. Методы, описанные в этой новой техники обеспечивают сочетание хорошим разрешением в 3D, достаточной временной выборки для мониторинга клеток в 4D и они относительно неинвазивным, поэтому предлагает идеальное подход для достижения долгосрочного мониторинга HSPCs взаимодействующий с костного мозга микросреда.

Несмотря ниши стволовых клеток получив признание в течение десятилетий 3 и хорошо охарактеризованы во многих тканях, таких как обонятельной луковицы, мышечных волокон, волосяного фолликула выпуклость или ЦНС субвентрикулярной зоны 4-7, взаимодействие между гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и микроокружения костного мозга ( БМ) до сих пор мало изучены в связи с трудностью непосредственно наблюдать отдельные клетки через кость, а также чрезвычайно жидкости природу самой ткани. Было показано, с помощью ряда функциональных исследований на основе абляции или гиперэкспрессией специфические гены в любом ГСК или стромальных клеток самого микросреды, что сложная сеть различных типов клеток и регуляторных сигналов отвечает за регулирование хрупкое равновесие между покоя , распространение, расширение и дифференциация ГСК 1-2. Перекрестные помехи между ГСК и своих нишах можно понимать в глубине только путем прямого наблюдения. Это ACHievable благодаря развитию передовых протоколов изображений, сочетающих имеющейся технологии, не только с точки зрения микроскопии, но и с образцами держателя решений и программного обеспечения приобретения. Разрешение одного сотового жить изображений пересаженных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в БМ отсеке костей свода черепа мыши показали, что прививка HSPCs локализовать в непосредственной близости от SDF-1 и VCAM-1-положительных сосудов 8-9 и что более незрелых клеток находятся в пределах 15 - 20 мкм от GFP-положительных клеток (остеобластические Col2.3-GFP трансгенной линии мыши, в котором остеобластов-ограничено коллагена 1α промотора управляет экспрессией GFP), а их потомство более дистально 10. Аналогичные наблюдения были получены из расчлененных и трещиноватых бедренной кости 11 и от утонченных tibeal костей 12. Визуализация свода черепа костном мозге остается наименее инвазивный подход для достижения прямой визуализации HSPCs течение гоEIR родной микросреда. С любым живого изображения образца существует внутреннее необходимости держать образец как можно более неподвижно, чтобы избежать ненужных артефактов из-за перемещением образца. Дыхание вызывает колебательные движения головы мыши, которые необходимо избегать при визуализации свода черепа костный мозг. Обычные стереотаксических держатели, используемые, например, для мозга визуализации и электрофизиологии, не подходят для работы с изображениями свода черепа, потому что они мешают лобные кости. Начиная с держателем мыши используется, чтобы минимизировать стресс во время живых изображений и электрофизиологических исследований 13, держатель 2 компонент был разработан, с маленькой частью, закрепленной на голове мыши, чтобы создать окно визуализации, соединенный с большим руку, обеспечивая устойчивый захват с тяжелая плита основания, которые обеспечивает твердо в столике микроскопа. Закрепление головной убор к черепу мыши позволяет свободное дыхание, все еще иммобилизации голову на место и адекватно устранения мovements вследствие дыхания. &quot;Замок-ключ, и&quot; механизм связывания головного убора в корпусе мундштука позволяет размер окна, чтобы свести к минимуму, а также повышенной точности позиционирования, следовательно, упрощает операцию, и подходит опорной плиты в стадии позволяет точным выравниванием по микроскопом. Чтобы точно контролировать подвижные клетки, протокол промежуток времени многоточечный была разработана, чтобы позволить отслеживать клеток с течением времени с 5-минутными интервалами между моментами времени. Вот, сделал меченые ГСК вводятся в col2.3GFP osteoblasitc репортеров мышей 10,14 и отображаемого примерно 20 часов спустя. Держатель мыши, который был разработан и параметры визуализации, необходимые для выполнения быстрого многоточечной покадровой изображений одних и тех же областей в течение часа множественного подробно описаны.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

Через хрупкого баланса между покоя и пролиферации, самообновления и производства дифференцированного потомства, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) поддерживать оборот всех зрелых линий клеток крови. Координация сложных сигналов, ведущих к конкретным HSC судеб полагается на взаимодействие между ГСК и сложной микросреды костного мозга, который до сих пор мало изучены [1-2]. Мы опишем, как, комбинируя недавно разработанный держатель образца для стабильного позиционирования животных с многоступенчатой ​​конфокальной и двухфотонной в методов визуализации естественных, можно получить 3D стеки с высоким разрешением, содержащие HSPCs и окружающие свои ниши и отслеживать их в течение долгого времени через многоточечного покадровой съемки. Изображений высокой четкости позволяет обнаруживать Экс Vivo меченые гемопоэтические стволовые и клетки-предшественники (HSPCs) проживающих в костном мозге. Кроме того, многоточечный покадровой 3D визуализации, оbtained с более быстрыми настройками сбора, предоставляет точную информацию о движении HSPC и взаимных взаимодействий между HSPCs и стромальных клетках. Отслеживание HSPCs по отношению к GFP положительные остеобластных клеток показано, как примерного применения этого метода. Этот метод может быть использован, чтобы отслеживать любое соответствующим образом меченый гемопоэтических стромальных клеток или интереса в пределах свода черепа мыши пространства костного мозга.

Заказ, высокоточный держатель мыши в том числе окна изображения свод черепа позволяет длительное визуализации FACS очищенных, помеченных HSPCs введенных в смертельно облученных мышей-реципиентов (Рисунок 1А). Как правило, после инъекции между 15 - 20000 меченых клеток, от 8 до 15 клетки, как правило, узнаваемый в костном мозге области формирования изображения черепа на следующий день. Здесь показано, как получить одну резолюцию клеток 3D стеки HSPC содержащих области костного мозга примерно 90 - 120 толщиной мкм, (Рисунок 1В), с последующим 4D покадровой фильмов в HSPCs выявленных (Рисунок 1C и кино). Субоптимальные результаты получают, если зубная цемента не оптимально получены, например, вода может вытекать из не герметичных областей, и даже при том, что он может быть пополнен из верхней части держателя, любой период времени, в котором линза не погружают в воду приводит к черной F<html> Рамеш. Некоторые дрейфа в изображениях неизбежно вследствие теплового расширения материалов держателя мыши, однако он может быть подчеркнуты субоптимальной цемента адгезии, что приводит к прогрессирующей отрыва мыши, а возмущений визуализации, созданной, что приводит к резким скачкам фокуса во время покадровой обработки изображений. Drift во многоточечного покадровой съемки также могут быть вызваны неточностями в движениях стадии, когда пересмотр ранее вошедшие позиции. Drift и заикаться артефакты в покадровой фильмов можно скорректировать с помощью алгоритмов совмещения изображений. Таблица 1 Возбуждение и настройки выбросов. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Цвет Канал </td><td style="width:213px;"> Возбуждение </td><td style="width:208px;"> Эмиссия </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 нм </td><td style="width:208px;"> 500 - 530 нм </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Автофлуоресцентной </td><td style="width:213px;"> 543 нм </td><td style="width:208px;"> 560 - 610 нм </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 нм </td><td style="width:208px;"> 640 - 700 нм </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 нм (МП) </td><td style="width:208px;"> 400 - 450 нм </td></tr></tbody></table><img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Рис.1 В естественных 4D визуализации HSPCs в мыши свода черепа. (А) Схема эксперимента (B - C).. Примеры полученных результатов (B) 2D срезы 3D-стека (общая глубина составляет 114 мкм), содержащий сигнал от коллагена кости (белый), сделал меченые клетки (красные) , autofluorescent челLs (желтый) и остеобластические клетки (зеленые). Шкала баров:. 100 мкм (C) 2D ломтики от 4D покадровой фильм, показывающий сделал надписью HSC (красный), мигрирующих в непосредственной близости от остеобластов клеток (зеленые). Пунктирная линия указывает на смещение клетки. Шкала баров: 50 мкм (B) и 100 мкм (с). ПРИМЕЧАНИЕ:. Фильм, полученная от приобретения покадровой в (С) показан в ходе видеомоста статье <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Характер взаимодействия между гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) и ниш костного мозга еще плохо изучены. Пользовательские модификации аппаратных и протокол приобретение многоэтапным разрешить использование двухфотонного и конфокальной микроскопии имиджу экс естественных меченые HSPCs рогатый в районах костного мозга, отслеживание взаимодействий и движения.

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Трансплантация почки Всего мозга у взрослых данио рерио

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing гемопоэтических клеток в костном мозге

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Улучшение точности потока цитометрической оценки митохондриальной Мембраны потенциал в гематопоитических стволовых и прародителей клеток через ингибирование Efflux насосов

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

В городе Vivo Двухфотонная визуализация мегакариоцитов и проплацелетов в костном мозге черепа мыши

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...