Name: a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas at JoVE.c

Авторы хотели бы поблагодарить следующих NIH награды / subawards за поддержку данного исследования: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, и P51OD011104.

1. Калибровка Mesodissection Прибор с 2iD ПО для обработки изображений ПО для обработки изображений 2iD будет называться либо программного обеспечения или программы на оставшуюся часть этой статьи. Этот шаг необходим, чтобы правильно отслеживать изображение, а также выровнять нес...

<ol>
	<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques:+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens.">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li><li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections.">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li><li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains.">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li><li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis:+what+we+don't+know+can,+and+does,+hurt+us.">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+fibrous+tissue.">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li><li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penitentiary+or+penthouse+condo:+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe's+point+of+view.">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li><li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li><li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor,+SigH.">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li><li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH.">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li><li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection.">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li><li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro,+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth.">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li><li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li></ol>

Mesodissection является метод, который может быть применен к экстракции РНК из патологических слайдов поражения, вызванные широкий спектр патогенных микроорганизмов. Это необходимость, чтобы пользователь отслеживает изображение и выравнивает изображение правильно. Чтобы достичь этого, пр?...

Образцы традиционно вручную микродиссекции либо из всей ткани или слайдов с помощью иглы и скальпеля. Это требует четкого разделения между среза ткани интереса и окружающих тканей разделах 2. При нынешних достижений в области технологий молекулярной профилирования, наблюдается растущая потребность для оценки ткани на клеточном уровне. В связи с ограничениями ручной микродиссекции, методов, включая LCM были созданы, чтобы позволить большую точность изоляции. Этот метод позволяет исследователю выделить отдельные клеточные популяции из различных типов клеток и скольжения, которые затем могут быть использованы для последующих анализов, таких как экспрессии генов профилирования. Хотя очень эффективным для последующих анализов, НОК не без ограничений. Во-первых, НОК является дорогим и трудоемким процессом. Кроме того, из-за нестабильного характера РНК, часто вызов, чтобы получить высокое качество РНК из образцов LCM 2. В связи с диsadvantages из LCM, новые достижения в микродиссекции технологии по-прежнему необходимы, чтобы сделать его более доступным для большего числа исследователей в доступной и срочной основе. Одним из таких продвижение в микродиссекции технологии теперь доступны является метод, известный как mesodissection. В этой технике машина используется для мельницы разделе аннотированный ткани интерес и всасывает ее в расходных мельницы бит 3. Затем этот образец может быть атмосферный в пробирку и используется для последующих применений. Преимущества этой системы в том, что это значительно дешевле и чувствительным временем. По нашему опыту, система позволяет вскрытие участка ткани легких гранулемы в десять минут. С другой стороны, традиционные НОК, вероятно, потребует часов, чтобы завершить процесс. Система позволяет оператору загружать эталонный слайд использовать в качестве сравнения, а также инструмент для аннотации. Кроме того создается отчет с изложением тыс.э область слайда, который был расчлененный. Есть две основные недостатки в mesodissection. Хотя эффективны при извлечении несколько ячеек, это сложно выделить одну ячейку. Кроме того, точность изображение, формируемое не ясно, как при использовании других микроскопов визуализации. Туберкулез (ТБ) является одним из основных инфекционное заболевание убийца человечества во всем мире и является результатом заражения MTB. В большинстве человека в результате воздействия аэрозолей Mtb, инфекция латентно ограничивается. По крайней мере в 10 миллионов человек в год, это приводит к активной формой туберкулеза 4. Во время латентной инфекции, Mtb содержится в патологических поражения легких, известных как гранулемы. Поэтому было высказано мнение, что исход Mtb инфекции на уровне гранулемы 5 решили. Здесь показано, как mesodissection могут быть использованы для microdissect гранулемы, вызванные MTB. Слайды, используемыевзяты из FFPE легочной ткани от зараженных макак-резусов. Для этой демонстрации, мы будем рассекать гранулемы во всей их полноте. Мы также показали, что РНК может быть получена из восстановленной ткани. Этот метод может быть применен для образцов ткани из различных других образцов, а затем используется для различных последующих анализов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">MeSectr</td>
			<td style="width:113px;">AvanSci Bio</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:195px;">Mesodissector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">400 nm xScisors</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">THOR</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Programmable Heater-Shaker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop2000</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy FFPE extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">73504</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovation RNA-Seq FFPE System&#160;</td>
			<td>Nugen</td>
			<td align="right">7150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">28104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas

Микродиссекция был использован для изучения тканей на ДНК, РНК и белка уровнях уже более десяти лет. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является метод наиболее распространенным микродиссекции используется и сегодня. В этой технике, лазер используется для фокально расплава термопластичный мембраны, которое закрывает секцию обезвоженную ткань 1. Срез ткани композит затем поднимается и отделен от мембраны. Хотя этот метод может быть успешно использован для ткани экспертизы, это занимает много времени и дорого. Кроме того, успешное завершение процедур с использованием этой техники требует использования лазера, что ограничивает его применение. Новый, более доступным и практичным микродиссекции подход называется mesodissection является возможным решением для ловушек LCM. Эта техника использует систему MESO-1/MeSectr фрезеровать нужный ткань от слайд установлен образца ткани при одновременном дозирования и аспирации жидкости с целью выделения нужного образца ткани врасходным мельница немного. Перед началом процесса вскрытия, пользователь выравнивает фиксированных формалином парафин (FFPE) скользить с гематоксилином и эозином окрашенных (H &amp; E) ссылка слайд. После этого, оператор комментирует нужную область рассечение и приступает к препарировать соответствующий сегмент. Программа генерирует архивный образ вскрытия. Главное преимущество mesodissection является короткая продолжительность необходимости препарировать слайд, принимая в среднем десять минут от настройки, чтобы пробовать поколение в этом эксперименте. Кроме того, система значительно более экономически эффективным и удобным для пользователя. Небольшое неудобство в том, что это не так точен, как лазерная захвата микроскопии. В этой статье мы показали, как mesodissection может быть использован для получения РНК из слайдов из FFPE гранулем, вызванных микобактериями туберкулеза (МТБ).

Вышеупомянутый протокол показывает, как использовать новую технику mesodissection извлечь РНК из FFPE ткани слайдов. Эффективность этого протокола проявляется через FFPE слайды легких гранулемы из НПЗ, инфицированных Mtb в различных инфекционных стадиях. Рисунках 1-3 образы инструм?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas at JoVE.c

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Микродиссекция была широко используется для проведения экспертизы ДНК, РНК и белка в ткани. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является наиболее часто используемым методом, но новая техника фрезерные, mesodissection, является недавно доступны. Мы демонстрируем выделения РНК из mesodissected формалина фиксированной парафин тканей горки микобактерий туберкулеза гранулемы.

Роман микродиссекция подход к Восстановление<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Конкретные Стенограммы из фиксированных формалином и залитые парафином легких гранулемы

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Пример подготовки<em&gt; Микобактерий туберкулеза</em&gt; Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Оптическая скрининг Роман бактерий-конкретных зонды на Ex Vivo человека легочной ткани, Конфокальная лазерная Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...