Name: fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy at JoVE.com

This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1. Fremstilling af biologiske prøver til Freeze-fraktur / Freeze-etch <ol><li> Brug en konventionel EM fiksativ formulering, såsom 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatpuffer i 1 time. at udføre primære fiksering af biologiske væv. BEMÆRK: Selv om det kan være ønskeligt at fastfryse nogle typer af prøver uden forudgående fiksering, universelle blodbårne patogen forholdsregler mandat passende fiksering hvor prøven består af humant væv. </li><li> Efter den primære fiksering skylles modell...

<ol>
	<li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens.">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li><li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker.">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li><li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues.">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+faces+of+frozen+membranes.">Fracture faces of frozen membranes.</a> ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release.">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+inner+dynein+arms,+radial+spokes,+and+the+central+pair/projection+complex+of+cilia+and+flagella.">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+the+outer+dynein+arm.">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li><li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick-freeze,+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells.">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+freeze,+deep+etch+of+the+cytoskeleton.">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li><li>Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy:+Methods+and+Protocols.">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li><li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization.">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li><li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+membrane.">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li><li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future.">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium.">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium:+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture.">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+organization,+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets.">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li><li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability.">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro.">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium:+A+freeze-fracture+study.">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li><li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells.">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li><li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2++in+epithelial+cells.">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li><li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+teratogen+on+[3H]uridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions.">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li><li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium.">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell &amp; Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease.">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect &amp; Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li><li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung.">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute,+low+level+sulfur+dioxide+exposure.">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis.">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li><li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke.">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li><li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy,+surface+replication,+freeze-etching+and+label+fracture.">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes.">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li><li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes.">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li></ol>

I årene efter dens indførelse og kommercielle tilgængelighed, fryse-fraktur / etch procedurer blev i vid udstrækning brugt til undersøgelser af den biologiske membran struktur. Faktisk har de bedste perspektiver for nogle af de strukturelle specialiseringer af membraner blevet opnået i fryse-fraktur / etch præparater. Disse undersøgelser ikke blot har bidraget til forståelsen af ​​den strukturelle organisering af membraner, men også indsigt i, hvordan struktur og funktion hænger sammen. <p class="jove...

Konceptet og praktisk anvendelse af fryse-fraktur behandling af biologiske prøver blev introduceret af Steere 1 over et halvt århundrede siden. Den tidlige apparat tilegnet forskellige komponenter i en arbejdsgruppe selvstændig enhed 1. Den oprindelige apparat blev ændret og finpudset i kommercielt tilgængelige instrumenter for at imødekomme kritiske behov for ekstern manipulation, vedligeholdelse af højt vakuum og fordampning af kulstof og metal til at producere en kopi egnet til undersøgelse ved transmission elektron mikroskopi (figur 1 og figur 2). Den typisk instrument består af et stort vakuumkammer med prøven bord og mikrotom arm har regulerbar flydende nitrogen gennemløb (figur 1). Kammeret huser også to elektronkanoner, en for at stabilisere kulstof fordampning placeret i en 90 ° vinkel til den model scenen og den anden for Platinum / carbon shadowing på en justerbar vinkel, typisk 15 º - 45 º (figur 2). Strøm til enheden anvendes til at betjene vakuumpumpen og elektroniske paneler regulere justering og elektron temperatur pistol kontrol. Oprindeligt tænkt som et middel til at opnå en bedre billeddannelse af vira, fryse-fraktur vundet endnu mere popularitet som en teknik til undersøgelse og analyse af cellemembraner og deres specialer 2, 3. Faktisk har denne fremgangsmåde været en integreret belyse struktur / funktions relationer i celler og væv, og mange af disse undersøgelser står som klassiske bidrag til cellebiologi og molekylær biologi 4-9. Det vigtigste mål og rationale for udvikling af fryse-fraktur teknik var at begrænse artefakter observerbare ved elektronmikroskopisk resolution fra kemisk fiksering og behandling, der anvendes i konventionel biologisk elektronmikroskopi. Her er målet at de kemiskefiksering og indefryse modellen med tilstrækkelig hastighed og ofte i nærværelse af en kryoprotektant for at begrænse iskrystaldannelse og andre indefrysning artefakter. På det seneste har denne teknik fundet en genopblussen af ​​interesse fra molekylærbiologer og materialevidenskab efterforskere til undersøgelse af nanopartikler og nanomaterialer. Fryse-fraktur og fryse-etch billeder udviser en tredimensionel karakter og til tider forveksles med scanningselektronmikrografer. Dog er fryse-fraktur præparater undersøgt ved transmissionselektronmikroskopi og deres store bidrag til morfologiske undersøgelser i høj opløsning er deres unikke repræsentation af struktur / funktions elementer af cellemembraner. Fryse-fraktur-behandling initieres ved frysning celler og væv med tilstrækkelig hastighed til at begrænse is krystallisation og / eller med anvendelse af kryobeskyttende midler, såsom glycerol. De prøver derefter splittet under vakuum, og en replica genereres ved fordampning af carbon og platin i brudfladen. Den oprindelige prøve fordøjes fra den replika, der er hentet på en standard EM eksemplar nettet. En anden almindelig fejlfortolkning af fryse-fraktur billeder er, at de skildrer celleoverfladerne. Men den grundlæggende forudsætning af fryse-fraktur er, at biologiske membraner er delt gennem lipiddobbeltlaget ved fraktur proces (figur 3). Denne proces i biologiske membraner giver to brudfladerne, en, der afslører tilrettelæggelsen af ​​halvdelen af ​​membranen tilgrænsende til cytoplasmaet, PF-ansigt, og en, der afslører halvdelen af ​​bimolekylære indlægsseddel af membranen, der er tilstødende til det ekstracellulære milieu, er EF-ansigt. Sande celleoverflader er ikke repræsenteret i fryse-fraktur-billeder, men kun, når det efterfølgende tilsættes trin af fryse-ætsning efter bruddet procedure anvendes. For effektivt at ætse tidligere brækkede prøver at afsløre overflade detail, må prøver nedfryses i et hastigt tempo og uden unetchablecryoprotectant. Ætsning af vand fra overfladen af ​​de frakturerede prøve afslører underliggende funktioner opnås ved at placere afkøling mikrotom armen over prøven fase skabe en temperaturforskel mellem scenen holder prøven og afkøling mikrotom arm, som bevirker, at vand sublimere fra overfladen. Når vand sublimeres fra overfladen af ​​de frakturerede prøve under fryse-ætsning manøvre, så aspekter af faktiske celleoverflader, ekstracellulær matrix, cytoskeletale strukturer og molekylære enheder kan blive afsløret ved høj opløsning. Således fryse-fraktur og fryse-etch er ikke udskiftelige udtryk, men snarere afspejler en trinvis proces hvor sidstnævnte måske ikke nødvendig eller ønskelig, afhængigt af behovene i den pågældende undersøgelse. Efter fryse-fraktur / fryse-etch procedurer er de brudflader underkastet styret fordamperentiv frakker af kulstof og platin med henblik på at yde støtte og billedbehandling kontrast til replika. Den platin / carbon imaging fordampning kan være ensrettede eller roterende og opnås ved enten modstand eller elektronkanoner. Envejs skygning fra en kendt vinkel, typisk 30 ° - 45 °, er nyttig ved udførelse af visse morfometriske beregninger. Prøver, der er blevet udsat for dyb-ætsning typisk roterende skygget og de resulterende billeder af disse prøver er fotografisk tilbageføres til evaluering. Den historiske såvel som en nuværende mål for fryse-fraktur / fryse-etch teknik er at begrænse kemisk fiksering og behandling prøven artefakter, der er forbundet med flere konventionelle transmissionselektronmikroskopi procedurer. Men denne teknik giver en væsentlig fordel i dens evne til at give tre-dimensionelle detalje og dermed lette køb af morfometriske data i biologiske, materiallære, og nanotechnology prøver. Fryse-fraktur og fryse-etch procedurer er komplekse og mangesidede, og nogle aspekter af dets anvendelse er tilpasset. Denne præsentation byder på en undersøgelse betragtning af de vigtigste funktioner i processen, og læseren henvises til omfattende publicerede protokoller 10, 11 for at løse detaljerne og tilpasse processen for specifikke forskningsbehov.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

Fryse-fraktur / fryse-etch beskriver en proces, hvor prøver, typisk biologisk eller nanomateriale i naturen, er frosne, brækket, og gentages for at generere en carbon / platin &quot;kastet&quot; beregnet til undersøgelse ved transmission elektronmikroskopi. Prøver udsættes for ultrahurtige frysning satser, ofte i nærværelse af kryobeskyttelsesmidler at begrænse iskrystaldannelse med efterfølgende brud af prøven ved flydende kvælstof afkølede temperaturer under højt vakuum. Den resulterende brudfladen replikeres og stabiliseres ved fordampning af carbon og platin fra en vinkel, som giver overfladen tredimensionale detaljeret til afstøbningen. Denne teknik har vist sig særlig oplysende for undersøgelse af cellemembraner og deres specialer og har bidraget væsentligt til forståelsen af ​​cellulære form relateret celle funktion. I denne rapport undersøge vi de instrumentspecifikke krav og teknisk protokol for udførelse affryse-fraktur, den tilhørende nomenklatur og egenskaber for fraktur fly, variationer på den konventionelle procedure og kriterier for fortolkning af fryse-fraktur billeder. Denne teknik har været meget anvendt til ultrastrukturel undersøgelse i mange områder af cellebiologi og lover som en ny imaging teknik til molekylær, nanoteknologi og materialevidenskab studier.

Nøglen forudsætning af fryse-fraktur tolkning er, at fraktur fly passere gennem lipiddobbeltlaget af membraner, der giver to brudfladerne, kaldet konventionelt PF-flade (plasma-fraktur-ansigt) og EF-flade (ekstracellulær fraktur-ansigt) (figur 3). PF-ansigt er halvdelen af ​​membranlipiddobbeltlaget støder op til cellens cytoplasma og EF-ansigt er halvdelen af ​​membranlipiddobbeltlaget støder op til det ekstracellulære miljø. Den fryse-fraktur teknik er særlig nyttig til undersøgelse a...

Watch this Scientific Journal Video about Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy at JoVE.com

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Grundlæggende tekniske elementer af Freeze-fraktur / Freeze-etch i Biologisk Electron Microscopy

Grundlæggende teknikker og finpudsninger af fryse-fraktur behandling af biologiske prøver og nanomaterialer til undersøgelse ved transmission elektronmikroskopi beskrives. Denne teknik er en foretrukken metode til at afsløre ultrastrukturelle funktioner og specialer i biologiske membraner, og for at opnå ultrastrukturel niveau dimensionelle og geodata i materialevidenskab og nanoteknologiske produkter.

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi af fission Gær Seksuel Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering af Forkalkning Events med Live Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Forberedelse og Observation af Thick Biologiske prøver ved scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...